用于荧光寿命显微镜的调制CMOS相机

广域频域荧光寿命成像显微镜(FD-FLIM)是一种快速、准确地测量整个图像荧光寿命的方法。一直以来，建造这样一个系统所涉及的复杂性和高成本限制了这种技术的广泛使用。PCO最近发布了第一款基于高频调制CMOS图像传感器的发光寿命成像相机FLIM。在这里，我们测试并演示了操作程序，以校准相机，并使用图像分析所必需的对应措施来提高准确性。相机的输出由一组可由软件使用相位法分析的调制图像组成。图像传感器的非均匀系统响应必须在像素级进行校准。此像素校准对于每个相机设置(例如调制频率和曝光时间)都是至关重要的。还观察到调制信号与强度有显著的依赖性，因此需要根据像素的强度水平对每个像素进行额外校准。有了这些数据采集校正，PCO的CMOS-FLIM可用于各种生物医学应用。

荧光寿命成像显微镜(FLIM)在生物和生物医学研究中越来越重要，它除了传统的荧光强度和光谱测量之外，还根据分子微环境和分子结合的差异提供基于荧光寿命。最常见的FLIM形式是在激光扫描显微镜系统中进行的单通道检测器。 然而，典型的激光扫描系统是在数据采集速度较慢，整体设置所需的FLIM是昂贵的。相反，广域 FLIM 系统可以提供更高的成像速度，因为它具有大规模并行帧采集功能，这对于大面积发生的寿命变化的动力学研究特别有用。广域 FLIM 可以用两种功能均衡的方式实现：频域或时域。在频域FLIM(FDFLIM )系统中，重复激发样品的荧光响应随频率变化。

每一处的荧光发射可以分析像素来确定相位延迟以及相对于激发的荧光发射的解调。利用具有已知寿命的适当参考样品，可以确定每个像素处未知样品的荧光寿命。目前，快速时间分辨相机系统通常包括一个图像增强器和一个科学CCD相机，该相机具有用于射频和用于设置图像增强器工作点的复杂控制器。更重要的是，基于相机的系统的分辨率(时空)受到图像增强器的性能和空间分辨率的限制，这限制了该技术的应用。

最近，原本设计用于距离测量的高调CMOS图像传感器的新发展成为可能FD-FLIM的候选人这些传感器的原理与频域FLIM测量非常相似，已经成功地进行了论证。基于这一原理，瑞士电子和微技术中心和PCO开发了一种新的CMOS图像传感器。图像传感器的每个像素有两个电荷收集点，称为点A和点B，以及两个点之间的开关，该开关可由外部高频信号控制。PCO随后发布了第一款广域CMOSFD-FLIM相机，pco.flim。

简单地说，这款相机的像素尺寸为1008×1008像素，5.6 um像素。在双抽头模式下，量子效率高达39%，最大帧速率可达90帧。最重要的是，该传感器可以调制高达50MHz。车载电路可以产生5 kHz到50 MHz的调制频率，也可以接受500 kHz到 50 MHz的频率范围的外部调制频。此外，除了sin之外的可能的形式，例如方波和脉冲，允许使用高调和来进行并行多频率寿命测量。在主模式下，摄像机可以对激光二极管进行调制，而在从属模式下，相机接受脉冲激励激光的频率。

如图所示，基于CMOS的宽场FD-FLIM系统示意图。

(A1)一个440nm激光二极管，可由FLIM相机调制。

(A2)超连续谱激光器带通滤波器来选择合适的激发波长。在激发路径中加入了一个热阻挡器。

(B)激发光束耦合到奥林巴斯TIRF显微镜通过TIRF臂。

(C)用奥林巴斯TIRF物镜进行实验。荧光信号由同一个物镜采集。

(D)奥林巴斯显微镜的底部棱镜将该信号反射到pco.flim CMOS相机(德国pco.flim)。

由计算机控制FLIM摄像机进行调制和数据采集。采集的相位图像通过相机运动软件进行分析。

德国Excelitas PCO公司pco.flim CMOS相机，具备高分辨率、高感光度、弱光成像的优点，将显微研究实验过程完美记录，为实验提供强而有力的图像数据支持。

广州市元奥仪器有限公司作为德国Excelitas PCO公司摄像机在中国的代理商，为客户提供各种成像系统解决方案，如对相关产品感到兴趣，欢迎随时联系交流，公司网址：www.gzyaco.com、电话：400-860-2677。