蛋白原核表达纯化验证

一．原核诱导表达原理

一旦由lacI细胞所形成的阻遏蛋白与lac操纵子融合后，就无法影响外部基因的转录和表达了，也就从而保证了宿主细胞的健康生长。IPTG同时也是一种可以与乳糖水解融合的中间物质，它虽然无法被细胞所同化，但却能够与阻遏蛋白的结合，这样细胞也就可以控制外源融资基因的大量转录和高效表达。

二．诱导表达的优化策略

1. 增加蛋白质溶解性和折叠：高温易使蛋白质以聚集的形式表达成包涵体，可选择低温诱导表达。

2. 提高翻译水平：调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增加mRNA稳定性。

3. 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平：将细菌的生长与外源基因的诱导表达分开；使用化学诱导、温度诱导等。

4. 稀有密码子优化：多数氨基酸有一个以上的密码子，当异源靶基因的mRNA异常表达后，tRNA的数量直接反应密码子的偏好性，一个或多个tRNA的稀有或缺少会导致翻译的停止。

三．重组蛋白诱导表达实验流程

（1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。

（2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中。

（3）挑取阳性菌落将其加入至5mL Lb（0.1 g/l氨苄青霉素）内，在37℃培养下过夜。

（4）以2 %体积比转接于2 mL LB( 0.1 g/L氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5 h，至细菌对数生长期，加0.1 mmol/L IPTG 2 µL诱导3-4 h，同时设立不加IPTG诱导作为对照。

（5）取上述菌液1 mL，12000 rpm离心10min，收菌沉淀。

（6）重悬于冰的100 µL PBS中，加入PMSF至终浓度为10 mmoL/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10 min变性，12,000 rpm离心10 min。

（7）将诱导的前后样品各10µL，作SDS-PAGE电泳分析。

四．SDS-PAGE验证蛋白表达纯化结果

1. SDS-PAGE实验原理：

带电粒子在电场中游动的速度与电场强度和带电粒子的净电荷成正比，与粒子半径（分子量和结构）和介质的粘度成反比。如果试剂为混合蛋白质溶液，则各种蛋白质的等电点的原子数量不同，这样在电泳时，产生了不同的电子迁移带。

2. 实验流程：

（1）凝胶的制备：配置分离胶，ddH2O 4.0mL，30%储备胶3.3mL， 1.5M Tris-HCl 2.5mL，10%SDS 0.1mL，10%APS 0.1mL。将上述的混合物一mL后，用TEMED（N，N，N'N'-四亚甲基二胺）10个μL封住底部，再将余下的μL，拌和均匀后，以用百分之二十乙醇溶液填充的玻璃版，蒙头顶部。确保液位是平的。浓缩胶用ddH2O 1.4mL，30%储备胶0.33mL，1M Tris-HCl 0.25mL，10%SDS 0.02mL，10%APS 0.02mL，TEMED 2μL制备。去除或分离胶内的水分之后，再重新倒入混合物，然后迅速的把篦子放入玻璃内充分聚合，需时间约15-30min。

（2）加样及电泳：将样品中加入一定量的2xSDS缓冲液中，加热3-5分钟，于12000g时离心1分钟，再取上等清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将10uL诱导和未诱导处理的样品加入样品池中，并将蛋白质标记物加入相邻泳道中。将电泳缓冲液注入电泳槽，并接通电源，浓缩胶的电压约为80V，而分离胶电压则是120V，溴酚蓝到底时电泳结束。

（3）蛋白质的染色和脱色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮蓝染色液染色，室温4-6 h。染色完毕后，将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

（4）胶片摄像的保存：在图像处理模式下将已经脱色过的胶片摄像，结果保存于计算机中，而胶可保存于双蒸水中。

3. SDS-PAGE常见问题及解决方法

4. 结果展示：

大小为43KDa的某融合蛋白原核诱导表达前后的SDS-PAGE结果：

M：蛋白Marker；泳道1、3、5：3株单克隆菌株诱导前；泳道2、4、6：3株单克隆菌株诱导后。

五．电泳技术的应用场景：

1.临床医学：电泳技术在临床诊断中发挥重要作用，为检测同工酶、各种蛋白质等提供了新手段。

2.生物制药、药物筛选与分析：分析生物样本中的药物及其代谢产物、分析药物杂质、分析重要等。

3.食品安全及微生物鉴定：样品条带可反应不同样品间的群落相似性，与飞行时间质谱、电化学检测仪等结合使用，提高痕量检测的可靠性。

4.农业畜牧业生产：可用于杂种后代的鉴定，亲缘关系分析，遗传基因定位等多种方面。

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