寡核苷酸固相合成法由于其偶联效率高、易于自动化、纯化方便、反应条件温和、易于放大等优点，目前仍是寡核苷酸大规模合成的主要方法。其原理为以固相载体(如可控微孔玻璃CPG或聚苯乙烯PS)为支撑，将核苷酸单体逐个连接到载体上的起始核苷酸上，通过脱保护、偶联、氧化和加帽等循环步骤逐步延伸寡核苷酸链。随着链长增加，每一步缩合反应的微小错误(如碱基错配或缺失)会逐级叠加，导致最终产物纯度显著下降;长链合成中后期，因空间位阻和反应活性降低，偶联效率可能从99.5%降至95%以下，直接影响全长产率。所以长链寡核苷酸的合成一直是行业内的难题。本案例采用AutoOligo25核酸合成仪，通过优化方法合成了100nt的DNA，粗品纯度达到46.11%。
长链寡核苷酸的应用价值
100nt级长链寡核苷酸在多个领域具有不可替代的作用：
1.基因编辑工具开发
作为CRISPR-Cas9系统中的单链向RNA(sgRNA)，需长度≥80nt以实现靶向精准性(如案例中合成的100nt序列可适配sgRNA设计)。
2.核酸药物研发
合成高纯度mRNA疫苗模板(如COVID-19疫苗中的修饰mRNA)，其前体DNA模板长度常超过100nt。
3.DNA纳米技术
构建DNA折纸(DNA Origami)框架链，用于智能药物载体或分子传感器(案例中合成的长链可折叠为特定纳米结构)。
4.合成生物学
快速组装人工基因或代谢通路，如合成微生物的异源表达模块。
本案例的合成产物(分子量30824Da)，经质谱验证分子量正确，满足上述应用的严格需求。
案例
合成信息
分子量：30824Da
设备和工艺优化策略：
考虑到长链合成中偶联效率降低的问题，我们通过动态UV检测(350/260/498nm三波长监测)实时追踪脱三苯甲基(DMT)效率，确保每步反应彻底，选择英赛斯AutoOligo25系统，其采用柱塞泵技术精确控制试剂的输入，不同碱基及不同位置的碱基采用不同的投料比进行投料，减少N-1和N+1的杂质产生。同时，从单体与活化剂的比例、单体的投料比及偶联时间(不同的单体偶联效率不同)、氧化剂用量与载体接触时间等方面进行了工艺优化。
AutoOligo25系统合成的工艺参数表
注意：以上数据仅适用于英赛斯AutoOligo25系统。
合成谱图
图一为完整序列合成过程中的曲线谱图，图一a/b/c为完整序列的单条曲线谱图，图二为其中第一个碱基的合成谱图，图三为最后一个碱基的合成谱图。
图一：完成序列合成谱图
图一a：完成序列合成谱图
图一b：完成序列合成谱图
图一c：完成序列合成谱图
图二：第一个碱基合成谱图
图三：最后碱基合成谱图
合成效率
分析信息
色谱谱图
质谱结果
经色谱质谱分析，得到合成粗品纯度为46.11%，平均单个碱基的偶联效率可达99.23%，质谱分子量30824Da与目标分子量一致。
此案例通过英赛斯AutoOligo25核酸合成仪及合理的合成工艺设计，获得了优异的结果。显示了AutoOligo25系统的优秀的合成效率和稳定性，以及合成工艺优化的重要性。
英赛斯小核酸药物整体解决方案
英赛斯公司提供一系列核酸合成系统、蛋白层析系统、制备液相系统以及切向流过滤系统，涵盖从实验室研究到中试规模再到生产级应用的全方位需求，为小核酸药物的研发到商业化生产过程提供有力支持。
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