一种用于肿瘤力学和侵袭研究的微流控流变仪（2025年10月，乳腺肿瘤类球体的硬度和粘弹性，细胞力学研究-细胞外基质的机械性能）

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在临床上，实体瘤的触感、质地和形状是判断肿瘤恶性程度的重要诊断方法。然而，在生理现实环境中，用于量化肿瘤力学特性和恶性程度的工具十分有限。在此，我们开发了一种微流控流变仪——称为微流变仪——能够同时测量乳腺肿瘤球体的力学特性及其向三维细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的侵袭性。微流变仪由一个用于对肿瘤球体施加可控静态或循环压缩的气动压力控制单元和一个用于容纳嵌入球体的 ECM 的样品室组成。其创新之处在于在样品室中集成了聚丙烯酰胺膜力传感器，能够在生理相关环境中直接测量力。我们发现，乳腺肿瘤的硬度以及肿瘤的粘弹性特性与肿瘤的侵袭性密切相关。微流变仪能够在短时间内（不到一分钟）测量肿瘤的力学特性，并有可能在未来用于临床。我们注意到，此处的微流变仪可轻松扩展用于单细胞、细胞核以及其它细胞/组织类型的力学研究。

生物组织的机械性能在发育、伤口愈合和疾病进展中起着至关重要的作用。如今人们普遍认为，细胞外基质（ECM）的机械性能是细胞生长、分化和迁移的关键决定因素，这对疾病诊断和预后具有重要意义。例如，癌症的发展与细胞外基质硬度增加有关，肿瘤的硬度通常是正常组织的数倍。已有报道指出，组织硬度增加是乳腺癌、肝纤维化、肺纤维化、硬化症和视网膜疾病的重要生物标志物。因此，肿瘤的机械性能是临床触诊实践的基础，医生通过触诊来检测表明病理变化的硬块。然而，在早期肿瘤中，硬度的变化可能很细微，达不到 3 至 10 倍的差异，这使得通过触诊诊断变得困难。

总体而言，肿瘤力学可以在两种主要的机械加载模式下进行研究：拉伸和压缩。随着肿瘤在有限的组织空间内生长，肿瘤核心会积累压缩应力，而肿瘤周边则会积聚拉伸应力。韦弗实验室和其他实验室的开创性工作表明，在乳腺肿瘤模型中，细胞外基质的拉伸状态会促进肿瘤的恶性发展。与此相辅相成的是，陈实验室的工作加深了我们对微组织生理学中细胞产生的拉伸力的理解。然而，压缩力对肿瘤的影响仍知之甚少，这主要是由于缺乏合适的实验平台。目前对压缩应力的理解主要是在体外通过在不同浓度的聚合物基质（如琼脂糖）中培养肿瘤球体来研究的。这些研究表明，压缩应力在肿瘤进展中具有重要作用。为了重现生理上真实的肿瘤微环境，其中压缩应力具有各向异性和动态性，开发能够在三维环境中对微组织施加可控的单轴和动态压缩的工具至关重要。

对软材料进行机械特性表征的主要技术是市面上可买到的动态流变仪。通常，将具有特定几何形状（例如圆柱体）的组织安装在两个平行板之间，对组织施加正弦扭转剪切或压缩力，然后利用应力 - 应变曲线来推断材料特性。这种测量方法能提供软材料精确的粘弹性特性，使用起来也十分简便。它为我们如今对生物材料机械性能的了解做出了很大贡献。然而，由于其与组织培养条件和实时显微成像不兼容，该方法在活体组织中的应用受到限制。原子力显微镜（AFM）是一种广泛用于测量细胞和组织力学特性的技术，能够同时对单细胞动态进行力学表征和成像。它能以高空间分辨率提供有关局部组织力学的宝贵见解。然而，AFM 的一个主要局限性在于其通量低，这主要是由于细胞和组织的空间异质性，需要对样本进行逐点测量。其他微流变学技术，包括光镊和基于磁珠的方法，能够在目标位置施加精确的力，但它们通常在力的大小或组织样本的景深方面存在局限性。微吸管抽吸法通过测量组织在吸力作用下的变形来进行测量，对于单细胞机械测量来说相对容易操作，但它与高通量或集成的活细胞成像系统不兼容。

微流控技术已成为探究单细胞/组织力学特性的有效平台，同时还能与活细胞显微成像兼容。微流控收缩装置已被用于从细胞通过收缩通道时的动态形状变化中推导出细胞的粘弹性特性，包括弹性模量和流动性。同样，基于流体的微流控装置也已开发出来，通过分析在受控剪切流条件下的变形来间接测量组织力学特性。这些系统的一个主要优势是其高通量能力，能够对大量细胞进行快速力学评估。与这些基于流体的系统不同，其中细胞悬浮在流体中，微流控压缩平台已被开发出来，对单个细胞和细胞团块施加直接压缩。然而，这些平台中的大多数缺乏集成的力传感功能，因此不适合直接测量模量。尽管这些平台极大地推动了单细胞或组织力学的研究，但它们通常仅限于二维或悬浮细胞环境，并不能模拟诸如三维细胞外基质等生理条件。

在这篇手稿中，我们介绍了一种微流控流变仪（微流变仪），它引入了一种新型的原位力传感器，能够在生理现实的三维环境中同时研究肿瘤组织力学和单细胞动力学。

细胞/Cells

本研究选取了两种已知恶性程度及表面黏附分子（E-钙黏蛋白和整合素）的乳腺肿瘤细胞系。MDA-MB-231 是一种转移性三阴性乳腺肿瘤细胞系，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，货号：HTB-26），在高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，货号：11965092）中培养，培养基中添加了 10%胎牛血清（货号：S11150）、每毫升 100 单位青霉素和每毫升 100 微克链霉素（货号：15140122）。MCF-10A 是一种非致瘤性乳腺上皮细胞系，作为对照，购自 ATCC，在 DMEM/F-12 培养基（货号：11320033）中培养，培养基中添加了 5%马血清（货号：S12150）、每毫升 20 纳克人表皮生长因子（货号：PHG0311）、每毫升 0.5 微克氢化可的松（货号：H0888-1G）、每毫升 100 纳克霍乱毒素（货号：C-8052）、每毫升 10 微克胰岛素（货号：I-1882）、每毫升 100 单位青霉素和每毫升 100 微克链霉素（货号：15140122）。所有细胞均在 T75 培养瓶（货号：将细胞置于装有 10062-860 型号培养皿）的培养箱中，培养箱设定为 5%二氧化碳、37℃和 100%湿度。细胞每隔 3 至 4 天传代一次，当细胞培养达到 70%至 90%融合度时收获用于实验。在所有实验中，均使用从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取后传代 20 次或更少的 MDA-MB-231 和 MCF-10A 细胞。

球体/Spheroids

如参考文献 60 和 61 中所述，使用专门设计的微孔阵列（图 S1）制备大小均匀的肿瘤球体。简而言之，首先采用软光刻技术在 1 毫米厚的琼脂糖凝胶膜上制备 36×36 的微孔阵列。每个微孔呈圆柱形，直径为 200 微米，深度为 250 微米。琼脂糖凝胶表面为细胞提供了低粘附表面，使细胞更容易聚集形成球体。然后将一个微孔阵列放置在 12 孔板（货号：07-200-82）的每个孔中。在每个孔中，我们放入 200 万个 MDA-MB-231 细胞或 300 万个 MCF-10A 细胞，悬浮于 3 毫升与培养 MCF-10A 细胞相同的培养基中。将 12 孔板置于培养箱（Forma）中，在 37°C、5%二氧化碳和 100%湿度条件下培养 7 天后收获。在第 3 天和第 6 天，更换培养基为新鲜培养基。收集时球体的平均直径约为 130 微米。对于每个实验，从一个微孔阵列中收集球体，并使用 Falcon? 细胞过滤器（货号 10054-458）的滤膜来收集球体。我们注意到，MCF-10A 细胞主要通过 E-钙黏蛋白介导的细胞间直接黏附形成球体，而 MDA-MB-231 细胞则是通过整合素介导的细胞与细胞外基质的间接黏附形成球体。 因此，对于 MDA-MB-231 细胞球体的形成，富含营养的培养基（DMEM/F12）和较长的培养时间（7 天）是至关重要的。

三维球体培养/3D spheroid culture

将肿瘤球体嵌入 3.5 毫克/毫升的 I 型胶原蛋白中。进行三维球体培养时，首先，将 68.16 微升胶原蛋白储备液（10.27 毫克/毫升，货号：354249）用 1.5 微升 1 摩尔/升氢氧化钠滴定。其次，加入约 20 微升 10 倍浓缩的 M199 培养基（货号：M0650-100ML），使最终 pH 值约为 7.4。第三，加入 110.34 微升悬浮在细胞培养基中的球体，使总体积达到 200 微升，胶原蛋白和球体的最终浓度分别为 3.5 毫克/毫升和每毫升 2860 个球体。

微流变仪的制造

该微流变仪由三层组成，均采用 PDMS 制成，并从硅母模中浇铸而成。硅母模是在康奈尔纳米科学与技术中心利用光刻技术制造的。

图 1 微流变仪的设计与校准。A. 组装好的设备照片。PDMS 设备夹在不锈钢框架和有机玻璃歧管之间。B. 微流变仪示意图。微流变仪由 3 层组成：L1 样品室层（蓝色）、L2 可变形 PDMS 膜和活塞层（红色）、L3 压力控制室层（黄色）。C. 一个压缩室的横截面图。压力室内的压力使膜弯曲，从而使活塞压缩样品室内的肿瘤球体。D. 轴对称压缩单元的尺寸。虚线代表压缩单元的中心轴。关键尺寸为 h，即活塞底部到 PAA 凝胶表面的距离。样品室高度为 H，半径为 1500 微米。PDMS 可变形膜的厚度为 340 微米，活塞高度为 300 微米，半径为 800 微米。PAA 凝胶厚度为 200 微米。h 和 H 可根据实验需要进行调整，以适应不同大小的样品。E. 利用 COMSOL 软件，在压力控制室压力为 14 千帕且尺寸如 D 所示的情况下，对可变形膜、活塞、椭球体和 PAA 凝胶的垂直位移进行计算。F. 活塞位移（Δh）与压力控制室施加压力的校准曲线。点为实验结果，实线为 COMSOL 计算结果。注：误差棒代表 8 个实验值的平均值的标准误差（SEM），但由于变化极小，误差棒太小而无法显示。

微流变仪操作

使用市售的压力控制器（OB1 MK4，Elveflow 公司）调节压力控制单元内的压力，通过 Elvesys 软件进行操作。该软件允许用户生成具有可定制轮廓的压力波形。在压力输入下，活塞的稳定性和响应性得到了验证。外部压力源（型号 3 压缩机，Jun-Air）为 OB1 MK4 控制器提供压力。

球体分割/Spheroid segmentation

弗莱堡大学开发的专门用于生物医学图像分割的卷积神经网络架构 U-Net 被用于分割从明场显微镜获得的视频中肿瘤球体的轮廓。该模型使用每种球体类型至少训练了 张图像。从 U-Net 分割中获得的球体面积用于计算应变。

聚丙烯酰胺（PAA）压痕测量

为了量化肿瘤球体压缩过程中 PAA 凝胶的变形情况，采用离焦环法追踪位于 PAA 凝胶与肿瘤球体界面处的微珠的移动情况。简而言之，利用 ImageJ 中的霍夫圆变换插件，在每个视频帧中测量肿瘤球体压缩过程中由 PAA 凝胶压痕形成的离焦绿色荧光微珠环的直径。然后利用这些环的半径来量化随时间变化的压痕程度。该环的半径与压入 PAA 凝胶的深度直接相关。

球体内的涡度和速度/Vorticity and speed within a spheroid

球体内的涡度和速度是通过基于 MATLAB 的 PIVLab 工具箱从明场图像序列中计算得出的。压缩和未压缩球体的明场延时图像被导入 PIVLab 中，在其中应用粒子图像测速（PIV）算法来计算连续帧之间的速度矢量场。采用单程快速傅里叶变换窗口变形算法，窗口大小为 64 像素，步长为 16 像素。然后利用所得的二维速度场计算每个点的涡度，从而能够可视化和量化旋转流模式以及对机械加载的局部组织运动。

测定 PDMS 和 PAA 凝胶的杨氏模量

使用动态力学分析仪（TA Instruments DMA Q800）测定了用于微流变仪的 PDMS 的杨氏模量。结果表明，该材料表现出线性弹性行为，杨氏模量为 1.33 ± 0.011 MPa（n = 3）。采用我们实验室先前开发的改进压痕法测定了 PAA 凝胶的杨氏模量，该方法考虑了薄基底导致的模量高估问题，测得的杨氏模量为 638.68 ± 41.5 帕（n = 18）。简而言之，将一个钢球（直径 600 微米，密度 7.8 克/毫升）轻轻放置在浸没于 PBS 中的 PAA 凝胶表面。凝胶的上下表面均涂有 1 微米的绿色荧光珠，以便准确测量凝胶厚度和压痕深度。通过显微镜观察绿色荧光珠的垂直位移来确定压痕深度。记录了显微镜载物台在有无金属球时 z 位置的差异，并通过应用 1.31 的校正因子对由于空气 - 凝胶界面折射率不匹配导致的光学失真进行了校正。该校正因子是我们实验室先前通过实验获得的。然后使用压痕深度，通过修正后的赫兹接触理论计算出杨氏模量。为了验证在我们的装置设置中基于压痕的模量测量的准确性，我们还使用商用流变仪（TA 仪器 DHR3）进行了独立的剪切流变测量。结果证实，PAA 凝胶在相关应变范围内表现出线性弹性行为，并得出杨氏模量为 730.7 ± 15.9 帕（n = 3），这与基于压痕的值非常接近。对于所有分析，我们使用通过压痕法测量的杨氏模量，因为它是在与我们的微流变仪系统相同的实验条件和凝胶层配置下获得的。

应变测量

将肿瘤球体置于样品室中，并浸入培养基中。应变是从球体垂直中平面拍摄的图像中推断出来的。

在压缩过程中，球体的横截面积变化如图 2A1 和 A2 所示。使用机器学习分割算法（U-Net）对横截面积进行分割，黄色和红色轮廓分别代表压缩前后的球体边界。从分割面积 A 中，使用图像文件：d5lc00504c-t1.tif 计算出有效球体半径 R。应变定义为 ε = ΔR/Ro，其中 ΔR = R - Ro 表示压缩引起的有效半径变化，Ro 为压缩前的原始半径。

图 2 球体的应变测量及应变松弛时间。A1. 压缩前（黄色虚线）和压缩时（红色实线）肿瘤球体的示意图。活塞垂直向下移动压缩下方的肿瘤球体，导致肿瘤球体的横截面半径发生变化。A2. 未压缩的 MCF-10A 肿瘤球体在垂直中平面的显微照片。黄色轮廓表示未压缩球体的面积 Ao，红线表示压缩球体的面积 Ac。比例尺为 100 微米。B. 肿瘤球体对来自微流变仪的周期为 20 秒的正弦波、方波和三角波压力波压缩的应变响应。蓝色点表示从明场图像获得的肿瘤球体应变随时间的变化，红色点表示施加在压力控制器上的压力。采样率为 15.67 赫兹。C. MDA-MB-231 和 MCF-10A 肿瘤球体在方波压缩下的应变响应。此处的最大压力为 10 千帕。D. MDA-MB-231 和 MCF-10A 球体的半松弛时间。半松弛时间被定义为压力释放后应变减少到其初始值 50% 所需的时间。

应力测量

为从微流变仪获取肿瘤球体所承受的应力，使用了嵌入样品室底部的聚丙烯酸凝胶力传感器。应力被定义为球体所受总力除以球体在中 z 平面的横截面积。这代表了一个有效或平均应力，因为球体内部的应力分布并不均匀。

图 3 球体应力测量及模量。A1. 有无压缩的肿瘤球体示意图。在 PAA 凝胶表面放置荧光珠以可视化肿瘤球体造成的变形。绿色珠子代表未受压缩时的位置，红色珠子代表受压缩时的位置。A2. 未受压缩（绿色）和受压缩（红色）的两个共聚焦荧光显微镜图像重叠。当珠子靠近物镜时，失焦环会变大。这一现象被用于测量凝胶的变形。比例尺为 100 微米。A3. 样品室中施加 0 帕和 9 千帕压力时的 z 堆栈图像的 3D 投影。B. MCF-10A 球体的应力 - 应变随时间变化曲线。应力通过测量的力除以球体的横截面积来评估。应变是 ΔR/R。施加了四个周期的正弦压力波，周期为 20 秒，最大压力为 12 千帕。C. MCF-10A 肿瘤球体的应力 - 应变响应曲线。曲线斜率用于计算肿瘤球体的模量。杨氏模量（E）在曲线的线性区域测量，而差分模量（K）在 10% 应变时测量。D. MDA-MB-231 和 MCF-10A 肿瘤球体的杨氏模量（E）。E. MDA-MB-231 和 MCF-10A 肿瘤球体在 10% 应变时的差分模量（K）。

肿瘤球体的应力 - 应变曲线和模量

为了表征肿瘤球体的机械特性，在周期为 20 秒、应变为 10% 的正弦循环载荷下测量了应力和应变（图 3B 和 C）。图 3C 中的应力 - 应变曲线表明：（1）肿瘤球体是非线性的，并具有应变硬化特性；（2）加载和卸载曲线表现出滞后现象，表明肿瘤球体具有粘弹性行为。利用垂直平均并插值后的应力 - 应变曲线（图 3C 中的红色虚线中线），我们计算了球体的杨氏模量，即曲线在低应变附近线性区域的斜率。除了杨氏模量外，我们还计算了微分模量，定义为应力 - 应变曲线在 10% 应变处的局部斜率。微分模量提供了肿瘤球体在特定应变附近局部瞬时刚度的度量。这很重要，因为几乎所有生物材料都表现出非线性机械特性。

测得的平均杨氏模量值为：MDA-MB-231 球体为 380.6 ± 66.3 帕，MCF-10A 球体为 1014.6 ± 151.8 帕（图 3D），而在 10% 应变下的差分模量分别为：MDA-MB-231 球体为 893.2 ± 89.6 帕，MCF-10A 球体为 4168.8 ± 557.4 帕（图 3E）。这些结果是通过 14 个 MDA-MB-231 球体和 6 个 MCF-10A 球体获得的。我们注意到，当球体的硬度与 PAA 凝胶的硬度相当时，使用 PAA 凝胶进行的力测量可能会不准确。这种误差源于赫兹接触理论假设的违背，该理论假设刚性球体压入弹性基底。当球体的硬度与基底凝胶的硬度相差不大时，这一假设就会被违背，从而导致计算出的模量出现误差。为了评估这种影响，我们进行了有限元分析，并确认在与我们的实验相关的刚度比范围（ESph./EPAA ∈ [1， 3]）内，这种误差仍低于 21%。应用此分析得出的校正因子后，校正后的杨氏模量值为：MDA-MB-231 球体为 396.8 ± 60.1 帕，MCF-10A 球体为 903.0 ± 111.9 帕。未来可通过以下改进措施：（i）使用相对于球体样本更软的聚丙烯酸凝胶；（ii）使用具有已知机械性能的软球体对校正因子进行实验验证。

压缩条件下肿瘤细胞的动态变化

微流变仪的透明设计使其能够进行活细胞成像，成为将肿瘤力学特性与肿瘤细胞动态变化相关联的理想工具。在此，我们研究了在压缩条件下肿瘤球体内和球体外的肿瘤细胞动态变化。请注意，我们使用了图 1D 所示尺寸的装置，只是将样品室高度（H）设置为 500 微米，并且没有聚丙烯酰胺凝胶层。将嵌入细胞外基质中的肿瘤球体直接置于样品室底部（上排 6 个孔为 MDA-MB-231 肿瘤球体，下排 6 个孔为 MCF-10A 肿瘤球体），然后在 37°C 孵箱中让胶原蛋白聚合 45 分钟，之后再进行实验。我们注意到，这里展示的所有实验均使用相同的 DMEM/F12 培养基。

适度压缩可调节肿瘤球体向细胞外基质的突起

为了探究压缩对肿瘤球体侵入细胞外基质的影响，我们追踪了压缩条件下肿瘤细胞的动态变化。实验样本室（左侧六个孔）中的肿瘤球体受到 30% Δh/h 的压缩，而对照样本室（右侧六个孔）中的肿瘤球体则在 24 小时内未受压缩。

图 4 压缩适度减缓肿瘤球体随时间的面积扩张。A1 和 A2（B1 和 B2）。在 3.5 毫克/毫升胶原蛋白中，压缩和未压缩条件下 MDA-MB-231（MCF-10A）肿瘤球体的延时明场图像。比例尺为 100 微米。A3（B3）。压缩和未压缩条件下 MDA-MB-231（MCF-10A）肿瘤球体 24 小时内归一化球体覆盖面积。A4（B4）。压缩和未压缩条件下 MDA-MB-231（MCF-10A）肿瘤球体的圆度。较暗的点代表平均值，误差线表示每个时间点的标准误差。这些值是根据 11 个压缩和 10 个未压缩的 MDA-MB-231 肿瘤球体以及 12 个压缩和 8 个未压缩的 MCF-10A 肿瘤球体计算得出的。

压缩会诱导非致瘤性肿瘤球体内产生涡流运动

为了了解压缩对肿瘤球体流动性的影响，我们观察了在 30% Δh/h 压缩条件下球体内单个细胞的动态变化。有趣的是，我们发现非致瘤性肿瘤细胞在受压时会在球体内形成涡流，而恶性肿瘤球体则没有这种涡流。为了表征肿瘤球体内的细胞内部运动，我们使用 MATLAB（PIVLab）对延时明场图像进行了粒子图像测速（PIV）分析（图 5A1、A2、B1 和 B2）。

图示5 压缩会在非恶性肿瘤球体内部诱导细胞内涡旋运动，但在恶性肿瘤球体中则不会。A1 和 A2. MDA-MB-231 细胞在未压缩（A1）和压缩（A2）条件下的速度矢量。A3. MDA-MB-231 球体在压缩和未压缩条件下各时间点的绝对平均涡度。A4. MDA-MB-231 细胞在压缩和未压缩条件下各时间点的平均速度。B1 和 B2. MCF-10A 细胞在未压缩（B1）和压缩（B2）条件下的速度矢量。B3. MCF-10A 球体在压缩和未压缩条件下各时间点的绝对平均涡度。B4. MCF-10A 肿瘤细胞在压缩和未压缩条件下各时间点的平均速度。速度场是通过在 MATLAB 中使用粒子图像测速（PIV）分析算法从明场延时图像中获得的。比例尺为 100 微米。涡度和速度是根据速度矢量场计算得出的。较暗的点代表平均值，误差线表示每个时间点的标准误差。平均值线和标准误差线是根据 12 个受压和 10 个未受压的 MDA-MB-231 球体以及 14 个受压和 8 个未受压的 MCF-10A 球体计算得出的。

本研究的核心贡献在于开发了一种微流变仪，能够同时表征肿瘤球体的机械特性，并在生理现实环境中对单细胞动态进行光学追踪。该设备的关键创新在于整合了基于聚丙烯酰胺凝胶的力传感器，从而能够直接测量组织的机械特性。通过改变设备的尺寸，这种微流变仪可以轻松扩展，用于研究细胞核和单细胞的力学特性，以及广泛其他细胞/组织类型。

利用该设备，我们发现非致瘤性（MCF-10A）和恶性乳腺肿瘤（MDA-MB-231）球体均具有非线性和粘弹性，表现出应变硬化行为。所测得的 MCF-10A 和 MDA-MB-231 球体的杨氏模量与先前报道的值一致。通过实现机械测量与活体成像的同时进行，微流变仪揭示了压缩可诱导非致瘤性球体的大规模运动，但在恶性球体中则不会。此外，当肿瘤球体嵌入 3.5 毫克/毫升的胶原蛋白中时，压缩适度降低了其侵袭性。

参考文献：

Young Joon Suh, Manli Liu, Bangguo Zhu, etal, A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies, Lab on a Chip, 2025, 25, 6018-6032

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