可靠    创新    同行    发展

在不断发展的癌症研究领域，3D细胞培养（3D cell cultures），特别是肿瘤细胞球体（tumor cell spheroids），由于其增强了对体内肿瘤环境的模拟，特别是在耐药性方面，在药物筛选中越来越受到青睐。然而，均匀球体（uniform spheroids）的一致形成及其精确操作仍然是一个复杂的挑战。在各种方法中，液滴微流体是研究肿瘤球体形成的一种非常有效的方法。本文介绍了一种新颖的、多方面的微流体系统，该系统简化了整个球体培养过程：(i)从单个液滴内的细胞悬浮液中生成肿瘤球体，（ii）在球体形成完成后将这些液滴合并成连续的水相，（iii）将球体转移到芯片内的专门培养区域，并配备了捕获元件，以便在灌注模式下进行扩展培养。值得注意的是，该过程不需要水凝胶封装或外部处理，因为所有操作都在微流控芯片内进行。该芯片由创新的OSTE+（非化学计量硫醇环氧树脂）聚合物制成，专为重复使用而设计。为了证明其有效性，我们在我们的系统中成功地形成了MCF-7， GAMG和U87细胞系的球体，并将它们与传统琼脂糖微孔法制备的球体进行了比较。此外，我们的方法已经成功地实现了从液滴中释放球体的芯片内释放，随后它们被有效捕获以进行后续培养，我们已经用MCF-7球体举例说明了这一过程。据我们所知，这项研究代表了完全集成的液滴微流控平台实现无支架肿瘤球体形成和处理的第一个实例。我们的方法有望提高肿瘤细胞球体形成、转移和培养的高通量、自动化过程。

癌症仍然是死亡的主要原因，通常无症状进展并导致转移，目前的方法难以治愈。随着新的抗癌药物的开发，对准确和容易获得的肿瘤模型的需求至关重要。传统的二维细胞培养曾经是体外测试的标准，但在模拟真实肿瘤方面已经发现不足，特别是在耐药性和细胞通讯方面。近几十年来，3D细胞培养作为更有代表性的肿瘤模型而获得了突出的地位。这些培养通过加入细胞外基质（ECM），在药物筛选中更好地模拟体内肿瘤，表现出增强的耐药性和更多的肿瘤样基因表达和生理反应。

球体形成是肿瘤模型研究的一个关键方面，可以通过多种方法实现，基于支架（使用不同材料的支撑结构）或无支架。突出的技术包括颗粒培养，旋转培养，悬挂滴，液体覆盖在非粘附表面，以及利用磁场/电场和超声波等外力的方法。此外，基于微流体和水凝胶的方法也得到了广泛的认可。每种方法都有其独特的优点和缺点，在文献中有广泛的记载。值得注意的是，这些方法可以集成，特别是在微流体中，增强了它们的适用性。具体地说，微流体在球体形成和操纵方面显示出对大规模药物筛选和其他应用至关重要的高通量自动化系统的发展前景。特别值得注意的是液滴微流控技术，如几项研究所证明的那样，它通常通过集成水凝胶来封装球体而得到增强。

许多基于液滴的微流控芯片用于球体的产生和培养，主要使用PDMS、玻璃或它们的组合。Yu等人制作了一种用于水凝胶封装球体形成的芯片，球体形成和随后的药物测试耗时4天。Yoon等人开发了一种用海藻酸盐水凝胶中的磁性纳米颗粒包裹细胞的芯片，利用磁力促进球体转移，但缺乏芯片内培养。2015年，Kim等人强调了海藻酸盐水凝胶液滴中细胞数量调节的挑战，以实现均匀的球形大小，并提出了一种改进的微流控平台。Sabhachandani等人创建了一个平台，可以将来自多种细胞类型的球体捕获在海藻酸盐水凝胶中，尽管球体形状不规则，但仍可以进行介质灌注和药物测试。Cui等人介绍了一种基于热响应水凝胶的液滴微流控平台，可以更容易地收集球体。Kwak等人报道了MCF-7和MDA-MB-231细胞形成均匀球体的系统，需要芯片后处理来培养球体。Sun等开发了一种芯片，在核壳海藻酸盐水凝胶液滴中共培养肿瘤球体，在芯片外进行药物测试。Liu等利用水凝胶在大鼠胰岛细胞上无油生成液滴。De Lora等利用水凝胶，利用声波产生液滴，制造了无油声流控液滴芯片。Lee等人利用脑肿瘤细胞进行光疗试验，开发了一种快速液滴生成和可调节球体大小的系统。Wu等利用matrigel制备了乳腺肿瘤球体芯片，实现了快速形成和药物检测。Zhang等设计了水凝胶包封肿瘤球体的平台，将液滴转移到微孔板上进行培养。

如上所述，以前在微流体中生成肿瘤球体的解决方案通常分为两类：一类是设计用于从细胞悬浮液中生成球体以进行形成后的外部处理，另一类是利用水凝胶进行球体封装和芯片内处理。水凝胶通常会延长球状体的形成时间（可达4天），并产生更小、结构不规则的球体。处理芯片外的球体可能具有挑战性，可能会造成影响模型质量的机械应力。此外，水凝胶支持的球体可能无法准确模拟天然肿瘤微环境，从而限制了该模型的生物学相关性。

为了解决现有微流控技术的局限性，我们的研究重点是改进液滴微流控方法，以产生均匀的、无支架的3D细胞培养（球体），重点是完成芯片内处理。我们开发了一种微流控芯片，包括集成的液滴产生器、储液器和培养部分，作为一个集成系统。这种设计使三种不同的癌细胞系（MCF-7、GAMG和U87）在水滴中形成球体，然后在芯片内液滴聚结，随后将球体转移到芯片的捕获/培养部分进行额外的处理。我们还探索了一种新型材料OSTE+聚合物（非化学计量硫醇-环氧树脂）的使用，用于芯片制造，与传统的PDMS相比，它具有许多优点，而传统的PDMS无法用于此类目的。使用OSTE+聚合物是必要的，主要是由于其对油相的抵抗力，并且需要根据芯片的不同功能在某些部分引入不同的表面改性/性能。在此基础上，提出了液滴聚结通道的技术方案和培养部分的水动力方案，使球体在低概率非均匀分布的腔室中自动固定，并进行了成功的试验。

据我们所知，这项研究首次在一个完全集成的液滴微流控平台上完成了无支架肿瘤球体形成和培养的所有必要步骤。我们还讨论了这种创新方法在推进高通量、自动化方法形成、转移和培养癌症球体方面的潜力。

图1 微流控芯片设计综述。1-油相进口；二水相进口；3-cross-junction;液滴产生器与储液器之间有4条连接通道；5液滴蓄积区；6 .水库侧通道入口；7 .水库侧通道出口；8 .储层出口通道；9-reservoir出口;10通道液滴储液器与球形培养机连接；11-球形培养机培养基入口；12球面耕耘机入口通道；13球耕耘机入口面积；14球型耕耘机诱捕元区；15球耕耘机出口面积；16球形耕耘机出口

图2 详细介绍了微流控芯片的功能部件。a交叉路口和水库侧分支结构详图；B所述储液口底端呈角度的结构细节；c微流控芯片各层的CAD图解：1-3D打印界面，微流控配件螺纹，2-顶部由OSTE+聚合物组成，3-底部由OSTE+聚合物组成，4-玻璃支撑层；装配微流控芯片，连接管件和管件；E球体培养部分及其捕获机制的细节，具有临界尺寸的缩放部分

微流控芯片加工
该芯片由非化学计量的硫醇-环氧基聚合物（OSTE+）制成。为了从OSTE+聚合物中获得所需的结构，我们首先使用DLP（数字光处理）3D打印机Perfactory?IV LED 来创建一个初级的，积极的成型母版。大师的材料是甲基丙烯酸/丙烯酸基聚合物HTM 140 v2 。我们将真空脱泡PDMS 10:1 w/w的基料：引发剂混合物倒入母料中，并在65°C的热板上孵育24小时，形成二次负极母料，随后用于OSTE+聚合物的成型。将OSTE+单体混合物倒入PDMS母片后，使用真空去除气泡，然后用小钢勺（将气泡移至表面）和医用注射器（将气泡从表面吸出）手动去除气泡。用1毫米厚的玻璃（康宁）小心地覆盖满了去泡OSTE+单体混合物的母杯，以去除多余的液体材料，同时在此过程中不让空气进入。在母板下面再加一层玻璃，防止PDMS母板在搬运过程中变形。然后用紫外线光源照射OSTE+单体混合物，穿过1毫米厚的玻璃顶层，也穿过光散射玻璃，这是光刻机的一部分。这种散射玻璃有助于防止OSTE+混合物聚合过快，否则会大大降低其透明度。微流控芯片设计为由顶部和底部两个OSTE+聚合物部件组装而成。每一个部分都有自己的主人，用不同的紫外线剂量照射（底部700 mJ/cm2，顶部1100 mJ/cm2，不包括玻璃层的衰减）。在紫外光固化第一步后，将OSTE+预聚体部件从PDMS母版上取下，其中底部保留在康宁玻璃上，顶部与玻璃层分离。将顶部和底部部分手动对齐并放置在一起，然后进行OSTE+预聚物的第二步固化，在电烤箱中在100°C下烘烤90分钟，使材料硬化并将两部分和玻璃层共价粘合在一起（玻璃层仅作为支撑，不与芯片的任何功能部分接触）。在第二步固化后，将3D打印（HTM 140 v2）接口连接到芯片进出口，该接口包含用于微流体连接器的UNF 1/4-28螺纹。用UV活性胶（CONLOC UV 688, EGO Dichtstoffwerke GmbH，德国）将界面与芯片粘合，用100 J/cm2的紫外线照射。之后，整个薄片在异丙醇中超声处理30分钟，以清洗和去除任何多余的未反应胶水，然后用氮气吹干。最后，用两种不同的改性剂对芯片的内表面进行改性。培养部分用Silane-PEG-OH, 1 k PEG chain（Biopharma PEG Scientific Inc.，USA）进行修饰，在丙酮中填充1μg/mL的硅烷溶液，同时密封发生器和储罐部分的进出口，防止污染，然后将芯片放入电烤箱，在100℃下烘烤90分钟。发生器和储罐区域用 fluorosilane Fluo-ST2 （Emulseo，法国）进行修饰。用氟硅烷溶液填充各部位，同时对球形培养机的进出口进行密封，避免对该部位进行修饰。然后将芯片放在65°C回火的热板上，留待第二天。

液滴的产生、处理和稳定性控制
对于芯片中交叉节点处的液滴生成，我们使用氢氟醚HFE-7500（Emulseo，法国）作为连续相，并添加1%（w/w）的氟化表面活性剂FluoSurf（Emulseo，法国）以保持肿瘤球体形成期间的水相液滴稳定。为了进一步确保液滴稳定性，我们对系统中的生成器和储液部分的内表面进行了改性，使其具有亲氟性，有助于防止HFE-7500环境中的水相液滴使壁润湿。在储液区中的水相液滴中形成肿瘤球体后，我们使用HFE-7500中的10%（w/w）1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol（Sigma-Aldrich）溶液将液滴合并为连续的水相，以便能够将释放的油性肿瘤球体无油地转移到芯片的培养部分。

图3 根据流量计算生成的液滴大小。水油流量比为2:1

图4 一个大型的储液芯片，里面充满了细胞浓度梯度的液滴。a 在8小时的孵育后，新鲜形成的球状物。b 在16小时的孵育后，较大的球状物已经因为液滴中营养物质耗尽而死亡，而较小的球状物仍然存活（细胞团块的死亡时间大约根据运动停止和颜色从灰色变为黑色来确定）。c 一张表格，其中选择了储液槽长度上的代表性球状物，并计算了液滴（D）与球状物（S）的直径和体积比，以及近似的相应存活时间。

图5 微流控芯片和琼脂微孔板中由不同细胞系形成的典型肿瘤球体。a 微流控芯片中测试细胞培养物在液滴储存区域的球体形成过程。每张图片下方列出了细胞系和培养时间（GF = 生长因子）。液滴法中的每个图片的尺度条为800 μm。b 细胞培养物在琼脂微孔板中孵育48小时后的外观。尺度条为800 μm

图6 微流控芯片的储液区。a 储液区中充满一层单层液滴，每个液滴中都含有预先形成的MCF-7细胞系球体。b 加入液滴破坏剂后储液区的示意图，显示了球体与水相的合并。标尺：1200 μm

图7 球形细胞捕获/培养系统的计算流体动力学模拟与实验验证。图a-c提供了球形细胞捕获/培养区域内模拟流速分布的概览。每张面板的左侧为流体的图形示意，右侧为通过各个微通道的体积流速。图a和b展示了发育模型，图c展示了最终的、经过实验验证的模型。在培养器入口处预设的体积流速固定为10 μL/min。附图中的红色线表示平均流速（总流速除以微通道数量），黄色点代表每个微通道的流速。图形示意对应于高度为100 μm的平面（图a）、300 μm的平面（图b）和25 μm的平面（图c）。图d展示了最终几何结构中被捕获的球形细胞（标尺：1毫米）。

图8 捕获MCF-7细胞球的培养区域的近照。这些细胞球采用图案化琼脂糖法形成，放入芯片时已培养24小时。118小时后，用CellTox Green对细胞进行染色，以检测死细胞。荧光图像由最大强度的Z形截面在共聚焦显微镜上合成，代表整个细胞球表面的荧光。标尺单位为毫米。


参考文献

Panu?ka, P., Smejkal, J., ?tofik, M. et al. Advanced Microfluidic Platform for Tumor Spheroid Formation and Cultivation Fabricated from OSTE+ Polymer. BioChip J 18, 393–409 (2024). https://doi.org/10.1007/s13206-024-00167-x

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