CytoFLEX nano如何实现细胞外囊泡多色分型？

在我们探索EV功能的时候，最基础的3个参数就是EV样品的浓度，粒径和分型。

我们以从健康供体中分离的PPP（去血小板血浆）EV分群为例。3mL全血在200xg下离心5分钟。从顶部取出1mL血浆，并通过200nm注射器过滤。使用70nm尺寸排阻柱（SEC）纯化PPP。筛选出的组分用于单色染色和多色染色进行免疫分型。然后用以下抗体对选定的PPP组分进行染色：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7和CD235a PE。在CytoFLEX纳米流式细胞仪上采集样本，并在CytExpert nano中进行分析。

检测EV样本时，样品清洁度至关重要，因此在检测前需要确保仪器的背景噪声足够低。CytoFLEX nano自带Baseline检测功能，可以自动检查鞘液并基于满足QC要求的预设阈值，自动监测并分析背景信号，快速评估仪器清洁度。在运行实验的同时，Baseline检测功能也可以即时检查仪器和缓冲液清洁度，保证样品间携带污染率小于1%。

在上样前，选择合适的样品浓度至关重要，以避免出现swarm现象。我们通过EPS（<6000 eps）、100%事件处理和避免粘连体，MdFI等维度，选择适合的样品稀释比例。

在获取检测数据后，我们按照以下设门策略进行数据分析：

1. Gate on Singlets 

2. Gate out CD235+ (possible aggregates) 

3. From CD235-, identify CD61+ (Platelet-originated EVs) and CD61- 

4. Further identify CD9+ and CD9- The last plots help to identify CD81+ and CD63+ from these subpopulation

CytoFLEX nano 纳米流式分析仪使研究人员能够清晰检测血浆来源的EV。该分析仪可准确检测和区分单个PPP EV颗粒（包括PB、FITC、PE、APC和PC7） 上的多个荧光通道中的信号，便于用户监测低表达的稀有阳性亚群（如CD63和标记红细胞污染的CD235a）。

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