Nature重磅：多色荧光“直播”大脑发育全过程！单细胞可视化分选培养系统助力机制突破

1. 100%单细胞源性的研究起点：

在创建 WLS 基因敲除（WLS-KO）的诱导多能干细胞（iPSC）系时，研究人员通过 CRISPR-Cas9 编辑细胞后，利用 isoCell单细胞可视化分选培养技术实现了准确的单克隆分离。具体流程为：将编辑后的细胞制备成单细胞悬液（7,500 cells/ml），通过 isoCell 的网格系统进行单细胞分配，分离后的单克隆经扩增和验证（如测序）后，用于后续类器官培养实验。

isoCell单细胞可视化分选培养技术的核心优势在于保障100%的单细胞源性，确保 WLS-KO 细胞系的遗传均一性，从源头避免了杂合细胞对实验结果的干扰，从而为研究 WLS 基因在脑类器官发育中的功能（如区域化、信号通路调控）奠定了可靠的细胞模型基础。

2. 多色荧光标记技术及长时间高分辨类器官光片显微镜的联合创新应用

研究团队利用五种不同的诱导多能干细胞（iPSC）系，每种细胞系稳定表达一种特定的荧光标记蛋白，分别标记细胞膜（CAAX-RFP）、肌动蛋白（ACTB-GFP）、微管（TUBA1B-RFP）、细胞核（HIST1H2BJ-GFP）和核膜（LAMB1-RFP）。这种多色标记策略使得在成像过程中能够同时追踪多个细胞结构和细胞器的动态变化。图中展示了不同荧光标记的细胞在类器官中的分布情况，清晰显示了细胞膜、细胞质和细胞核的边界，为后续的细胞追踪和形态分析提供了基础。通过将标记的iPSC系与未标记的父代iPSC系按2:100的比例混合，形成了多色荧光标记的细胞群体，显著减少了荧光信号的重叠和干扰，提高了细胞追踪的精度和分辨率。图中展示了多色荧光标记标记的类器官生成流程，包括细胞聚集、神经诱导、神经分化和长期成像等步骤，突出了稀疏标记在减少信号干扰方面的优势（下图）。

本研究克服了类器官长期活体成像的技术难题，利用长时间高分辨类器官光片显微镜实现了对类器官发育过程的高时空分辨率追踪，连续成像数周而不干扰细胞正常发育。图中展示了类器官在不同发育阶段的成像结果，包括腔隙的形成、扩张和融合等过程，揭示了大脑发育的动态变化（下图）。

3. 细胞外基质（ECM）的关键作用

研究发现，外源性提供的基质（如Matrigel）显著增强了腔隙的扩张和端脑的形成，而无外源性基质的类器官则表现出形态学上的改变，包括神经嵴和尾侧组织特性的增加（下图）。图中对比有无Matrigel条件下类器官的发育情况，包括腔隙的大小、数量和分布等差异，揭示了ECM在大脑发育中的重要作用。

4. 细胞形态与行为的动态解析

结合图像分割和追踪算法，研究团队提取了细胞的形态计量学特征（如细胞体积、表面积和轴长比等），量化了细胞在发育过程中的形态变化（下图）。图中展示了不同发育阶段细胞的形态计量学特征变化，包括细胞体积的增大、轴长比的调整等，揭示了细胞在发育过程中的形态重塑过程。

通过追踪特定标记细胞的发育轨迹，进一步揭示了神经上皮细胞的分化、神经元的成熟等关键命运决定事件（上图）。图中展示了细胞在不同发育阶段的追踪结果，包括细胞的迁移路径、分裂事件和形态变化等，展现了大脑发育的动态过程。

5. 单细胞RNA测序与成像数据的整合分析

本研究将单细胞RNA测序数据与成像数据相结合，通过基因表达特征对细胞类型进行进一步细分和验证，提高了细胞追踪和解析的准确性和深度（下图）。图中展示了单细胞RNA测序和成像数据的整合分析结果，包括细胞类型的细分、基因表达特征的变化和空间分布模式等，揭示了大脑发育的分子机制。

通过比较不同条件下类器官的基因表达变化，揭示了YAP1和WLS等关键基因在大脑发育中的调控作用，为理解大脑发育的分子机制提供了新线索，同时发现基质诱导的区域引导和腔隙形态发生与WNT和Hippo（YAP1）信号通路密切相关，揭示了ECM在大脑区域模式形成中的重要作用。