有效规避分子间聚集，提高生物成像对比度的表面活性剂修饰的供体

本文要点：近红外II（NIR-II）光学窗口中的荧光发射可减少自发荧光和光散射，使疾病检测和手术导航的深部组织可视化。小分子NIR-II染料是临床生物成像应用的shou选，因为其分子合成的灵活性允许精确控制其光学和药代动力学特性。在各种类型的染料中，基于供体-受体-供体（D-A-D）染料表现出优异的光稳定性，而常用的PEG化方法由于其固有的自组装效应，在水环境中不能保持足够的固有亮度。本文证明了市售表面活性剂可以作为分散剂来防止PEG化D-A-D染料的分子聚集。由于D-A-D染料和表面活性剂之间共组装的有利能量，形成的表面活性剂-修饰染料策略显著提高了染料亮度。因此，这种方法为体内生物成像应用提供了显著的改进性能。同时，本文还研究了小鼠模型肝脏中的D-A-D染料摄取和信号增强特性，并证明腔内的Kupffer细胞可以潜在地分解PEG化的D-A-D聚集体，从而恢复其固有的亮度。

背景：与在可见光/NIR-I光谱区域发射荧光的传统荧光团相比，近红外-II（NIR-II）小分子染料成像具有更大的穿透深度，低自发荧光和相对较低的生物毒性，因此可以获得对比度更高的图像。由于NIR-II荧光发射荧光团通常具有延伸的疏水π共轭基团，染料需要用额外的亲水基团包括烷基磺酸盐、烷基羧酸盐和聚乙二醇（PEG）分子及其众多衍生物进行改性，以赋予水溶性和生物生物相容性。当前NIR-II荧光基团从油相过渡到水相时的荧光猝灭仍然是其成功进入临床的主要障碍。这种亮度损失归因于聚集引起的淬灭（ACQ）现象效应。NIR-II荧光D-A-D染料表现出优异的光稳定性，从而消除了实施时光漂白的任何担忧。为了提高亮度，通常使用PEG分子，因为它们可以用作屏蔽单元（S），能够调节NIR-II荧光S-D-A-D-S染料的量子产率和药代动力学特性。据推测，广泛的PEG化可以改变S-D-A-D-S染料的溶解度，使它们转化为两亲性分子，因此本质上倾向于自组装。这种不可避免的聚集效应是所有先前报道的NIR-II D-A-D染料的常见问题。即使在非常低的浓度下，这些染料的自组装淬灭行为也可能发生。本文合成了两种S-D-A-D-S小分子染料，作为研究分子间组装和随后的NIR-II荧光发射的淬灭的模型系统。合理的供体替代提高了S-D-A-D-S荧光团的NIR-II量子产率。发现商业表面活性剂可有效防止我们制备的PEG化S-D-A-D-S染料的聚集/自组装。因此，表面活性剂修饰的S-D-A-D-S染料在水溶液和体内成像中的量子产率显著提高。

研究内容：1、通过合理的供体取代设计合成D-A-D分子：文献报道，许多NIR-II荧光团的S-D-A-D-S结构具有特殊的光稳定性，从而为长时间的体内成像应用提供生物事件的长期可视化潜力。近年来，供体基团的烷基异构化备受关注。这种对受体电子的整体电子离域进行供体特异性修饰并进一步增强发射波长的想法Z近也引起了研究人员的兴趣。然而，这种调整也降低了分子扭曲角。这可能导致电荷转移特性降低，从而强调非常强的受体效应，Z终导致更强的组装淬灭趋势。为了进一步证实这些猜想，作者设计并合成了一对S-D-A-D-S结构异构体（Figure.1a），IR-FH4和IR-FH3。高斯计算表明，在4C位上取代烷基的IR-FH4具有较小的光学带隙和基态二面角（Figure.1bc）。结果表明，4C染料在基态上的二面角较小，表明该结构的电子结构更加离域。BBTD和噻吩在4C染料中的二面角仅为0.8°，导致了更长的吸收、发射波长，以及更高的荧光量子产率。然而，荧光光谱表征显示，与DMSO相比，IR-FH4P的水溶液减少了20倍（Figure.1d）。与DMSO相比，吸收光谱在水溶液中也显示出强烈的蓝移（Figure.1e）。

Figure 1

2、商业表面活性剂有效地克服了PEG化S-D-A-D-S染料的固有聚集/组装：使用透射电子显微镜（TEM）表征，作者验证了IR-FH4P在溶解在PBS缓冲液中时固有地形成相对较大的纳米颗粒（约80 nm）（Figure.2a）。相反，它很好地分散在有机溶剂中，例如氯仿。基本上，IR-FH4P形成大的球形纳米颗粒，导致在水环境中荧光猝灭。即使在非常低的浓度下，D-A-D荧光近红外染料仍然形成纳米颗粒的聚集/组装。然而，IR-FH4P供体基团的异构化通过减小结构扭曲角放大了这种聚集/组装效应。在D2O和 DMSO-D2O系统中IR-FH4P的典型化学位移随着峰宽的增加而大大减弱，与CDCl3中可预测的精确信号相反(Figure.2c）。这种现象与以往大环分子和聚集体诱导发射（AIE）分子的自组装一致，表示IR-FH4P的聚集特性。随着对荧光猝灭和分子聚集之间关系的广泛理解，它促使我们通过利用表面活性剂等增溶技术来解决这一紧迫的挑战。因此，我们采用了一种常用的表面活性剂Triton-X100（Triton）来分解IR-FH4P纳米颗粒。DLS数据显示，Triton-X100修饰的IR-FH4P经历了中间状态（DLS测试中的大直径），Z终转变为流体动力学直径约8 nm的拆卸状态，类似于其在有机相中的完全溶解状态（Figure.2e）。绘制七种不同浓度的 IR-FH4P 和 Triton-X100 混合物的 DLS 大小，使我们能够确定在水溶液中完全分解IR-FH4P的Z低Triton-X100浓度（0.1% w/w）（Figure.2f）。

Figure 2

为了进一步验证该策略的可行性，同时使用了五种常见的表面活性剂来测试亮度增强。与实验设计一致，作者发现大多数测试的表面活性剂，包括阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，都能有效提高IR-FH4P的NIR-II亮度，恢复到与其有机相对应物相同的亮度水平（Figure.3a）。值得注意的是，当添加等量的Triton-X100时，异构体IR-FH3P仅表现出3倍的亮度增强，这表明对不同S-D-A-D-S结构使用表面活性剂的溶解度存在差异，结构优化是必要的（Figure.3b）。为了研究表面活性剂和染料体系的分解机理，作者通过IR-FH4P与三种典型表面活性剂混合测试了一组样品的尺寸演变（Figure.3c）。正如预期，表面活性剂修饰染料优先在较低的表面活性剂浓度下形成共组装的纳米颗粒，而当不含表面活性剂时，它们基本上无法在水溶液中自组装。从DLS（Figure.3d）的结果来看，随着DMSO-PBS混合溶液中DMSO含量的变化，染料聚集体的粒径表现出与梯度浓度表面活性剂体系相似的变化趋势。由于表面活性剂通常对生命系统有毒，作者接下来使用纯染料，纯表面活性剂和染料/表面活性剂混合物进行了细胞毒性实验。结果表明，在等效给药剂量下，染料/表面活性剂混合物的毒性明显低于单一表面活性剂（Figure.3ef）。染料/表面活性剂探针的毒性显著降低，进一步证明了表面活性剂和IR-FH4P共组装成稳定的伴侣，从而消除了其在体内应用的毒性问题。为了进一步确认该策略的低毒性，通过苏木精和伊红（H&E）染色对生理盐水，IR-FH4P和IR-FH4P / Triton给药的小鼠的肝脏进行病理分析也验证了没有明显的异常形态（Figure.3g）。

Figure 3

3、表面活性剂修饰的S-D-A-D-S染料在体内显著增强了NIR-II的亮度我们静脉注射表面活性剂修饰的IR-FH4P和不含表面活性剂的IR-FH4P以比较它们的体内性能，以评估表面活性剂修饰的染料在体内的增强亮度（Figure.4ab）。IR-FH4P/Triton-X100 组的 NIR-II 信号在短时间内远高于不含表面活性剂的IR-FH4P 组（IR-FH4P/Triton-X100 型号在 60 秒时间点增强约 12 倍）。无表面活性剂的IR-FH4P注射组的肝脏和皮肤/肌肉信号随着时间的推移而增加，并在24小时时间点达到与IR-FH4P / Triton-X100组相同的范围（Figure.4c-f）。总的来说，表面活性剂修饰的IR-FH4P在24h内提供了显着的亮度增强，这可能是解决NIR-II荧光发射S-D-A-D-S染料固有的分子间聚集和荧光猝灭问题有希望的策略。

Figure 4

4、表面活性剂修饰的NIR-II荧光团可实现高效肿瘤和淋巴结成像：在建立了表面活性剂修饰染料策略的体内生物成像能力后，作者研究了IR-FH4P和IR-FH4P / Triton-X100是否可以在小鼠模型中提供高效的淋巴结（LNs）成像。为此，将剃光的Balb / c小鼠主要用于腘窝和骶部LNs成像。在右脚垫上皮内注射IR-FH4P / Triton-X100混合物（100μM，25μL），同时在左脚垫上注射等效染料剂量的不含表面活性剂的IR-FH4P。如Figure.5ab所示，显然记录了非常不同的NIR-II荧光强度，并且在前30分钟内使用IR-FH4P / Triton-X100和不含表面活性剂的IR-FH4P之间大约有3倍的亮度增强。作者还研究了IR-FH4P / Triton-X100染料在LN成像中是否保持了D-A-D染料出色的光稳定性。在PBS和IR-FH4P / Triton-100X混合物中皮内注射等效剂量的ICG（OD808nm=0.5），并通过上述相同条件进行比较（Figure.5cd）。左侧注射ICG的NIR-II信号在前30分钟内迅速减弱，而右侧注射的IR-FH4P/Triton-X100的LN信号保持一致。接下来，作者用静脉注射IR-FH4P / Triton-X和不含表面活性剂的IR-FH4P对两组4T1肿瘤小鼠的肿瘤进行了成像。将两组肿瘤信号与注射后时间做对比，发现与不含表面活性剂的IR-FH4P注射组相比，IR-FH4P / Triton-X100的峰值积累延迟很多（72小时与24小时）（Figure.5e）。值得注意的是，注射IR-FH4P / Triton-X100组表现出约2倍的信肌比增强（Figure.5f）。

Figure 5

5、NIR-II S-D-A-D-S荧光基团在肝脏和Kupffer细胞中的荧光增强机制：和以前的报告反复观察到，静脉内施用一系列PEG化的S-D-A-D-S荧光团后，肝脏信号逐渐增加。以前的报道将这种现象完全归因于它们的大尺寸和长血液循环。上述表面活性剂修饰策略促使作者重新确定这些归因，因此作者认为巨噬细胞也可能分解S-D-AD-S荧光团（这将导致其NIR-II亮度增强）。在这种情况下，随着时间的推移，肝脏中的信号增强大致可以分为两个阶段：荧光团积累阶段和荧光团分解阶段。这两个阶段都可以增强肝脏中积累的荧光团的NIR-II荧光信号。在第一阶段，游离染料在循环时积聚在肝脏（例如Kupffer细胞）中，从而产生一定的亮度增强。染料在第二阶段被Kupffer细胞进一步分解，肝脏显示出进一步增强的荧光信号（Figure.6a）。基于这一假设，Kupffer细胞（位于肝腔内的主要巨噬细胞）用于体外检查其对IR-FH4P和IR-FH4P / Triton的分解性能。通过培养KCs并用IR-FH4P孵育一组典型周期（1，3，6，12，24，48，72小时），对胰蛋白酶化和收集的KCs进行NIR-II亮度测试（Figure.6b）。定量信号随孵育时间增加，与相应时间点静脉注射IR-FH4P后的肝脏信号呈正相关（Figure.6cd）。为了进一步探索分解机制是否完全依赖于活细胞，将KCs和4T1细胞的细胞裂解物与等效的IR-FH4P一起孵育一段时间（Figure.6e）。染料孵育细胞裂解物的NIR-II荧光强度与纯裂解物缓冲液（CeLytic M）中的染料相似，表明增强完全是由纯裂解物缓冲液中的表面活性剂成分引起的（Figure.6f）。

Figure 6

总结：作者设计并合成了一对NIR-II S-D-A-D-S染料，并研究了噻吩接头C3和C4位的烷基链取代对其荧光特性的影响。作者发现，与常用的C3位取代相比，在噻吩供体的C4位取代的烷基具有更好的量子效率。表面活性剂修饰的S-D-A-D-S染料的NIR-II亮度增强能够显著改善成像对比度，特别是在较短的成像窗口内。在短期内，表面活性剂修饰的IR-FH4P在体内应用中与不含表面活性剂的IR-FH4P组相比，提供了3至10倍的荧光增强。对于淋巴结定位应用，该策略提供了更高的成像对比度（3倍增强）。使用这种策略，S-D-A-D-S染料被迫与表面活性剂共组装以防止分子间聚集。此外，与等量的表面活性剂相比，表面活性剂修饰染料系统显示出很低的细胞毒性，从而消除了体内生物成像的毒性问题。

参考文献

doi.org/10.1039/d2sc05651h

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