流动成像显微镜监测脂质纳米颗粒聚集

概述

脂质纳米颗粒(LNPs)作为有效的药物传递载体越来越受到关注，特别是在其成功应用于COVID-19疫苗之后。Moderna和辉瑞的SARS-CoV-2疫苗都依赖LNPs将信使RNA (mRNA)——一种精致的核酸分子——传递到目标细胞的胞浆。LNPs是脂类和/或脂类分子的球形组合，封装和保护患者体内的治 疗性核酸有效载荷。无论活性药物成分(API)是mRNA还是其他核酸，基于LNP的疫苗和基因疗法在细胞传递中的应用具有很高和普遍的科学价值。

图1，含有活性成分的脂质纳米颗粒的示意图

作为一种较新的生物疗法，人们正在积极研究提高LNP稳定性的策略，就像已建立的蛋白质等API一样，并将继续研究。与基于蛋白质的生物疗法一样，LNPs在存储期间和随后的应力(如冻融循环或由于样品(错误)处理引起的搅动)中容易聚合和其他形式的降解。目前，LNP配方必须运输和冷藏，不是冷冻，以保持稳定性。虽然正如在COVID-19疫苗中观察到的那样，这些低温储存条件是有效的，但它们使运输和储存物流复杂化，并可能减少生活在缺乏足够冷链资源地区的患者——特别是在气候较温暖的地区时获得这些疫苗的机会。设计LNP配方，使其在标准制冷条件下储存稳定，或理想的室温下储存，是该领域的一个开放而重要的挑战。

提高LNP配方的稳定性可能会减少这些治 疗所需的冷链运输和储存要求，并允许更多的患者轻松和负担得起地获得这些强大的疗法。

由于原料药聚合体和其他颗粒构成的安全风险，良好生产规范(GMP)要求制定了质量标准。这些标准确保制药商不会生产含有大量颗粒的非肠道药物。特别值得注意的是USP <788>(“注射中的颗粒物”)和类似法规，这些法规限制了可出现在商业化非肠道中的亚可见颗粒(即直径2-100 μm的颗粒)的数量。重要的是检查LNP和配方设计的变化如何影响这些药物的颗粒含量，以最小化这些配方中颗粒构成的监管和潜在的产品安全风险。

流动成像显微镜(FIM)仪器通常用于计数、大小和成像生物治 疗中的API聚集物和其他颗粒，非常适合分析LNP配方中的颗粒。FIM仪器结合了光学显微镜和微流体，以高通量的方式捕捉这些粒子的图像。这些测量产生的颗粒图像可以通过计数获得颗粒浓度，并通过图像分析软件分析得到颗粒的大小和形状信息。然后，这些信息可以用于优化配方，以减少聚集和提高稳定性，以及跟踪生产过程中药品批次中的亚可见颗粒含量。

图2，LNPs的流动成像显微镜图像，由FlowCam Nano捕获。每个图像下面的值是粒子的直径(等效球面直径)，单位为μm。

FlowCam系列FIM仪器，如FlowCam 8100、FlowCam LO和FlowCam Nano捕获高分辨率粒子图像，对分析LNP配方中的粒子非常有效。FlowCam 8100和FlowCam LO可生成亚可见颗粒图像，包括符合USP规定的图像。FlowCam LO还可以对样品进行光阻法(LO)测量，该技术用于通过USP <788>监测颗粒数量和大小。USP <1788>(“亚可见颗粒物的测定方法”)推荐这种LO和FIM的组合，以验证LO测量下LNP制剂和其他生物疗法中常见的透明颗粒的性质。

FlowCam Nano使用高倍率浸入式油封物镜成像亚微米颗粒(直径0.3-2 μm的颗粒)。由于该尺寸范围略大于典型LNP单体的尺寸(50-300 nm)， FlowCam Nano能够成像LNP的小聚集体。因此，FlowCam Nano特别适合于识别早期LNP聚集，因为它可以检测到可能形成的最小聚集。虽然亚微米聚集颗粒不像亚可见颗粒那样受GMP法规的约束，但对配方中较小的聚集体进行监控并将之减少将有助于防止形成符合GMP法规的较大聚集体。此外，作为一种高通量、基于解决方案的技术，FlowCam Nano可以比其他光学和电子显微镜技术更快地揭示小的聚合信息，并具有足够的图像分辨率来提供工艺决策。

本应用将讨论如何应用FlowCam 8100和FlowCam Nano分析LNP配方中的聚集和颗粒形成。本研究中的LNP配方暴露于两种加速稳定条件(冻融应力和热应力)，以诱导聚集和降解。使用FlowCam 8100和FlowCam Nano分析了颗粒浓度、大小和受应力样品的颗粒图像。结果证明了FlowCam仪器在LNP生物制药配方监测和工艺改进策略方面的联合优势。

方法

在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备LNP配方，并施加压力以生成用于分析的聚合体和其他颗粒。为了去除初始样品中的任何大颗粒，15 mL LNP配方在6000 RPM下离心1小时，区最上面的12 mL样品用于分析。1个5毫升的样品暴露于加速冻融应力中，在-20℃冷冻20分钟，然后在室温水浴中解冻5分钟。这个冻融循环重复了四次，之后样品在室温下进行其余的分析。另一份5毫升的样品暴露在加速热应力下，在60°C的水浴中保存4小时。样品被允许冷却到室温，并在整个分析过程中保持室温。

通过FlowCam 8100和FlowCam Nano对应力样品进行分析，分别识别亚可见颗粒和亚微米颗粒。FlowCam 8100单元配置了一个单色相机、一个10X物镜和一个FOV80流单元。FlowCam 8100对每个样品进行三次重复实验，每次检测200 μL样品。FlowCam Nano单元使用40倍物镜和FOV60流池。FlowCam Nano对每个样品进行了3次重复实验，每次检测100 μL样品。在这两种FlowCam仪器上捕捉到的气泡和其他人工制品的图像被排除在外。

图3，FlowCam 8100(上)和FlowCam Nano(下)报告的颗粒浓度。每张表按颜色划分为两组四行。蓝色行表示来自冻融样品的测量值，红色行表示来自加热样品的测量值。每组四组的顶部行包含三次重复测量的平均粒子浓度(最右边一列)，其余行表示在每次单独测量中测量的颗粒浓度。

粒度和计数分析：图3显示了FlowCam 8100和FlowCam Nano测量的颗粒计数和浓度(颗粒/mL)。FlowCam 8100浓度测量在重复之间表现出良好的重现性，最 高和最 低颗粒浓度仅相差平均值约10%。虽然与FlowCam 8100相比，FlowCam Nano颗粒浓度测量结果的一致性较差，但在重复之间仍然表现出了合理的一致性。

有趣的是，颗粒计数显示，与暴露于冻融应力的样品相比，暴露于加热应力的LNP样品含有更多的亚可见颗粒和更少的亚微米颗粒。

图4，FlowCam 8100(左列)和FlowCam Nano(右列)对冻融(上排)和热应力(下排)样品的粒径分布进行了测量。中位直径列在每张图上。直方图上面的曲线表示该测量的累积粒径分布函数。

如图4所示，各粒径范围内的粒径分布也与本观测结果一致。虽然样品之间亚微米粒径的差异可以忽略不计，但相对于冻融应力产生的颗粒分布，加热应力产生的亚可见粒径分布向更大的颗粒分布偏移。这些结果表明，热应力比冻融应力对LNP配方的破坏更大。前者产生了高浓度的大颗粒，而后者包含的颗粒尺寸与较小的LNP颗粒非常接近。

这些样品的动态光散射(DLS)测量也证实了这些趋势。图5显示了得到的粒径分布。热应力LNP配方比冻融应力和非应力对照表现出更宽的粒径分布，并向更大的粒径倾斜。热应力样品的这种变化与通过FIM观察到的亚可见颗粒含量升高而亚微米颗粒含量降低是一致的。

图5，通过动态光散射测量了未受应力和受应力LNP样品的粒径分布。

图6，使用FlowCam 8100(左)和FlowCam Nano(右)从两个样品中获得的样品颗粒图像。每个图像下面的值是粒子的直径(等效球面直径)，单位为μm。来自FlowCam Nano的高亮图像被引用。

图像分析：图6显示了从冻融和热应力样品中获得的FlowCam 8100和FlowCam Nano图像示例，用于计算图3和图4中的样本统计数据。图像显示LNP颗粒通常表现为其他类型API颗粒(如蛋白质聚合体)的非晶态形状。这是重要的突出显示FlowCam Nano图像的两个应力。这些图像中的每一张似乎都包含两个或两个以上不同但相互连接的粒子，这表明这些粒子可能是二聚LNP结构。这一观察结果表明，FlowCam Nano可以用于监测LNP聚集，即使只有低聚LNP聚集。通过FlowCam Nano和FlowCam 8100提供的粒子图像信息，用户可以监测LNP在其配方中的稳定性，并检查其他常见的配方不稳定性来源，如容器闭合相容性——这些信息在选择或优化LNP配方以最 大化稳定性时是有价值的。

结论

FlowCam是监测LNP配方中颗粒含量和聚集的绝 佳工具，就像它对许多其他生物制药原料药一样。FlowCam 8100和FlowCam Nano测量不仅为用户提供了亚微米和亚可见尺寸范围内有用的颗粒计数和分级数据，还可用于跟踪配方不稳定的常见来源的图像。FlowCam Nano在这方面特别有用，因为它提供的高放大倍率可以早期检测LNP聚集，并可能以高通量的方式监测其他降解机制。FlowCam提供的信息对于研究LNP配方的研究人员来说是非常宝贵的，它使研究人员能够监测和提高其配方的稳定性，并最大限度地发挥这些新兴疗法对患者的积极影响。

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