脂质纳米颗粒（LNP）作为药物递送系统因其在 mRNA 疫苗和基因治疗等领域中的应用而备受瞩目。LNP 可以有效地保护 mRNA 等核酸免受降解，并帮助搭载的 RNA 药物进入细胞内部，这对于 RNA 药物的有效性至关重要。
图片来源于 OZ Bioscience
LNP 的独特之处在于它们的结构设计，包括可电离脂质的存在，这些脂质在较低的 pH 环境下带正电，有助于 LNP 与带负电的 RNA 紧密结合，同时，这种电荷特性也有助于 LNP 在进入细胞后逃脱内体，进而释放药物至细胞质中。
近年来，LNP 技术的进步使得基于 LNP 的药物的开发取得多项积极成果，目前已有多款药物获批上市，例如：
由辉瑞和 BioNTech 共同开发的 COVID-19 mRNA 疫苗 BNT162b2 (Comirnaty)；
由 Moderna 开发的 COVID-19 mRNA 疫苗 mRNA-1273 (Spikevax)；
由 Alnylam Pharmaceuticals 开发用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）的 siRNA 药物 Onpattro (patisiran)【1】。
此外，还有大量基于 LNP 技术的药物处于临床试验和上市申请阶段。
目前，LNP 的生产工艺路线主要围绕着将核酸（例如 mRNA、siRNA 或 sgRNA）等包裹进脂质颗粒中，以提高其稳定性和生物利用度。其一般工艺流程为：核酸合成、核酸纯化、LNP 的组装、LNP 的纯化、LNP 的表征、产品无菌过滤及产品制剂灌装等步骤。
其中下游纯化工艺是确保 LNP 产品质量的关键步骤，旨在去除生产过程中产生的杂质，提高 LNP 的纯度，保证其在临床应用中的安全性和有效性。常见的 LNP 下游纯化方法主要包括：
切向流过滤（TFF）：通过使用带有适当孔径的膜来过滤 LNP，以去除不需要的颗粒、未封装的 RNA 或其他杂质，同时还可以用于更换 LNP 的缓冲液环境。
层析技术：
① 亲和层析：特别是针对带有 poly(A) 尾巴的 mRNA，使用 oligo dT 树脂进行特异性结合，随后通过改变盐浓度来释放纯化的 mRNA。
② 尺寸排阻层析：用于根据大小分离 LNP，去除聚合物或其他大小不同的杂质。
超滤离心：使用超滤管或设备，通过离心力推动液体穿过具有特定截留分子量的膜，以浓缩 LNP 或去除小分子杂质。
密度梯度离心：通过在不同密度的介质中离心，依据 LNP 的密度差异来实现高分辨率分离，这种方法可以进一步区分具有相似大小但不同密度的 LNP 亚群。与其他一些可能对 LNP 造成物理或化学损害的纯化方法相比，密度梯度离心可以在温和的条件下进行，有助于保持 LNP 的结构完整性和功能性。此外，无论是实验室规模还是工业生产规模，密度梯度离心都是一种可行的方法，适用于多种 LNP 体系的纯化。
基于密度梯度离心的 LNP 不同亚群的实验步骤 (图片来源Anal. Chem. 2024, 96, 5570?5579)
如上所述，密度梯度离心纯化是一种高效、温和且灵活的纯化手段，在 LNP 的纯化和研究中占据着重要位置。该纯化方法主要步骤包括：
蔗糖密度梯度制备 ?? LNP 悬浮液的制备 ?? 样品加载 ?? 离心操作 ?? 收集离心分层后的目标样本进行收集
需要注意的是，在离心过程中，需要低温操作，以保持 LNP 的稳定性
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值得一提的是，基于密度梯度离心纯化的方法，除了常规的水平转子及角转子之外，可以考虑采用区带转子对 LNP 密度梯度离心纯化进行工艺放大，区带转子专为大容量、高分辨率分离设计，非常适合工艺放大。
基于密度梯度离心的方法，可以看到，无论是实验室规模还是工业生产规模，密度梯度离心都是一种可行的方法，适用于多种 LNP 体系的纯化。可以基于不同的处理通量，选择不同超离配置。同时，基于独特的优点及其生产工艺等相关技术的进步， LNP 在疫苗、基因治疗等医疗领域定会展现出更为广阔的应用前景，也希望针对不同的 LNP 亚群，工艺路线可以更成熟稳健。
参考资料：
1. https://mp.weixin.qq.com/s/sy6HGqJI5kmpCk5tUZoARw
2. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c00031
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