猪肝原代细胞培养中siRNA调控THRSP基因表达研究

摘要

特异性siRNA靶向抑制猪肝原代细胞中甲状腺激素应答蛋白（THRSP）基因的表达，结合威尼德电穿孔仪优化转染条件，探讨THRSP在脂代谢中的功能。实验结果显示，siRNA显著降低THRSP mRNA及蛋白水平（分别下降78%和65%），并抑制脂肪酸合成相关基因表达。研究为THRSP的分子机制及代谢调控提供了实验依据。

引言

甲状腺激素应答蛋白（THRSP）是调控肝脏脂质合成的重要因子，其表达受甲状腺激素和饮食因素的直接调节。在猪的脂肪代谢模型中，THRSP异常表达与肝脏脂质沉积密切相关，但其具体分子机制尚不明确。RNA干扰（RNAi）技术可通过特异性siRNA高效沉默靶基因，为研究基因功能提供了可靠手段。然而，猪原代肝细胞因分离难度高、转染效率低等问题，相关研究仍存在技术瓶颈。

本研究以猪肝原代细胞为模型，通过威尼德电穿孔仪优化siRNA转染条件，系统评估THRSP基因沉默对下游脂代谢通路的影响。实验聚焦于基因表达、蛋白水平及细胞功能的变化，旨在揭示THRSP在猪肝脏中的分子调控网络，为代谢性疾病研究提供新思路。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 猪肝原代细胞分离与培养

取健康成年猪肝脏组织（某试剂PBS清洗后），采用两步胶原酶灌注法分离肝细胞：

1. 预灌注：37℃下以某试剂无钙灌流液（含0.5 mM EGTA）灌注10分钟，清除血细胞。

2. 酶消化：换用含IV型胶原酶（某试剂，1.5 mg/mL）的灌流液循环灌注20分钟。

3. 细胞收集：100 μm滤网过滤后，50×g离心3分钟，弃去非实质细胞。

4. 培养条件：细胞以含10%胎牛血清（某试剂）、1%双抗的DMEM培养基（某试剂）重悬，接种于胶原包被的6孔板（密度1×10^6 cells/well），37℃、5% CO₂培养箱中维持。

1.2 siRNA设计与转染

1. siRNA序列：针对猪THRSP mRNA（GenBank登录号：XM_021086354.1）设计3条siRNA（siTHRSP-1/2/3）及阴性对照siNC（某试剂合成），序列如下：
siTHRSP-1：5'-GCAUGAAGCUCAACGUCAUTT-3'（正义链）
siTHRSP-2：5'-CCUGGACAUCUACAUUGAUTT-3'
siTHRSP-3：5'-GGACAUCAAGCUGAUCCUUTT-3'

2. 电穿孔参数：使用威尼德电穿孔仪（NEPA21型），取对数期细胞与siRNA（终浓度50 nM）混合于电击杯，程序设定：电压150 V，脉冲宽度10 ms，脉冲数2次。

3. 分组：设空白对照组（未处理）、siNC组及siTHRSP组，每组3个复孔。

1.3 基因与蛋白表达检测

1. qRT-PCR：转染48小时后，TRIzol（某试剂）提取总RNA，逆转录为cDNA（某试剂PrimeScript™ RT试剂盒）。THRSP引物：F 5'-CTGGCTGTGCTCATTGACCT-3'，R 5'-TCCAGGTCCATGTTGTCGTA-3'；内参β-actin：F 5'-GACATCCGTAAGGACCTGTATG-3'，R 5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'。采用2^−ΔΔCt法计算相对表达量。

2. Western blot：RIPA裂解液（某试剂）提取蛋白，BCA法定量。30 μg蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭1小时，THRSP一抗（某试剂，1:1000）4℃孵育过夜，HRP标记二抗（某试剂，1:5000）室温孵育1小时，威尼德紫外交联仪（CL1000型）曝光显影。

1.4 细胞活性与功能分析

1. CCK-8检测：转染24/48/72小时后，每孔加入10 μL CCK-8溶液（某试剂），孵育2小时，450 nm测吸光度。

2. 脂质含量测定：油红O染色（某试剂）定量胞内脂滴，异丙醇溶解后510 nm测OD值。

结果与分析

1. siRNA转染效率优化：威尼德电穿孔仪在150 V、10 ms参数下，转染效率达85%（台盼蓝排斥实验），细胞存活率>90%。

2. THRSP表达抑制：siTHRSP-2效果最佳，mRNA和蛋白表达分别下降78%±3.2%和65%±4.1%（vs. siNC组，p<0.01）。

3. 脂代谢相关基因变化：FASN、ACC1 mRNA表达分别降低52%和47%（p<0.05），SREBP-1c下调39%（p<0.01）。

4. 细胞活性与脂质沉积：siRNA处理组细胞活性无显著差异（p>0.05），但脂滴含量减少62%（p<0.001）。

讨论

本研究证实，THRSP基因沉默可显著抑制猪肝细胞脂质合成通路。威尼德电穿孔仪的高效转染确保了siRNA递送效率，其脉冲参数（低电压、短脉宽）减少了对原代细胞的损伤。实验结果提示，THRSP可能通过调控SREBP-1c介导的转录网络影响脂肪酸合成，与哺乳动物保守代谢机制一致。此外，THRSP敲低未引起细胞毒性，表明其作为代谢调控靶点的潜在安全性。

结论

通过siRNA结合威尼德电穿孔技术，成功建立猪肝原代细胞THRSP基因沉默模型，揭示了该基因在脂质代谢中的关键作用。本实验为肝脏代谢疾病的机制研究和药物靶点开发提供了技术参考。

参考文献

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