揭秘土壤中的隐形威胁：耐药菌的筛选与基因解析

土壤作为一种耐药基因传播媒介，可能通过作物或农产品等间接影响人类健康。然而，过去的研究报告中指出，平均40％的土壤微生物多样性来自死细胞或细胞外DNA，可能引起了土壤微生物分类群的错误估计。

PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪，基于单细胞拉曼光谱结合重水标记（Raman-D₂O）对细菌代谢活性进行检测，可实现免培养的耐药菌（antibiotic-resistant bacteria, ARB）识别，利用LIFT分选技术，实现耐药菌单细胞的精准分离，结合下游宏基因组测序技术，将耐药表型与基因型对应起来，深入评估土壤中活性耐药菌的传播风险和耐药基因类型。

· 建立耐药表型与基因型的对应关系

1. 实验设计

D₂O标记浓度：20%终浓度

标记时间：24 h

耐药菌分选范围：活性前2%的细菌

Notes：D₂O标记浓度和标记时间可根据实验对象不同进行调整。

CD/(CD+CH)

CD：C-D（2040-2300 cm^-1）振动光谱区域的积分；

CH：C-H（2800-3100 cm^-1）振动光谱区域的积分；

C-D ratio/Mean(C-D ratio)

C-D ratio：单个土壤菌的C-D比；

Mean(C-D ratio)：无抗生素土壤菌的平均C-D比；

拉曼检出的D标记细菌数量/检测的单细胞总数；

Normalized C-D ratio×ARB percentage。

三种人类影响程度不同的土壤样品经过重水标记和抗生素处理后，对从土壤中提取的微生物单细胞测拉曼光谱。将采集的所有光谱导入HOOKE intP线下分析软件中，经过去背景、归一化等预处理操作后，统计三种土壤的Normalized C-D ratio作为每个微生物单细胞的耐药活性（图2A）。

对高活性ARB的宏基因组检测结果显示，放线菌门、变形菌门和厚壁菌门均为耐药优势菌，在鉴定到的微生物物种中占比较大（图3C）。共鉴定出31种活性ARB（图4A），其中包括部分未培养属的ARB，这表明未培养土壤细菌是土壤表型抗性的重要贡献者。对这些高活性ARB的耐药基因进行探究，在两种试验田土壤中共鉴定到12种耐药基因亚型（图4B），和一株基因组完整度较高的痤疮丙酸杆菌，该菌基因组内包括了3种耐药基因和3种毒力因子（图4C）。

Li, H. Z., Yang, K., Liao, H., Lassen, S. B., Su, J. Q., Zhang, X., Cui, L., & Zhu, Y. G. (2022). Active antibiotic resistome in soils unraveled by single-cell isotope probing and targeted metagenomics.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 119(40), e2201473119.

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