新型流式细胞术检测基因转移效率之法

一、引言

二、材料与方法

（一）细胞系与试剂

1. 细胞系
   本实验选用常用的哺乳动物细胞系，如 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞系）和 HEK293 细胞（人胚肾细胞系）作为基因转移的受体细胞。这些细胞系具有生长迅速、易于培养和转染等优点，广泛应用于基因转移研究领域。

2. 试剂

• 用于基因转移的载体包括质粒 DNA（如绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒）和病毒载体（如慢病毒载体），均购自知名生物试剂公司。

• 转染试剂选用脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000，按照生产厂家提供的说明书进行操作。

• 荧光染料包括可特异性标记细胞膜的 DiI 染料（用于区分活细胞与死细胞）以及与外源基因表达产物特异性结合的荧光抗体（如抗 GFP 荧光抗体）。这些荧光染料均具有良好的光稳定性和荧光特性，能够满足流式细胞术检测的要求。

（二）基因转移实验

1. 细胞培养
   将 HeLa 细胞和 HEK293 细胞分别接种于含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养基中，在 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养至对数生长期。

2. 转染操作

• 对于质粒 DNA 转染，将适量的质粒 DNA（如 GFP 表达质粒）与 Lipofectamine 2000 转染试剂按照一定比例混合，在无血清培养基中孵育形成转染复合物。然后将转染复合物加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，继续培养一定时间（通常为 24 - 48 小时）。

• 对于病毒载体转导，将慢病毒载体与适量的病毒包装辅助质粒共转染到包装细胞系（如 293T 细胞）中，收集病毒上清液并浓缩。将浓缩后的病毒液按照一定的感染复数（MOI）加入到目标细胞培养皿中，同时加入聚凝胺以增强病毒感染效率，培养 48 - 72 小时后进行检测。

（三）流式细胞术检测

1. 细胞样本制备

• 在转染或转导后的不同时间点，收集细胞，用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞两次，以去除培养基中的杂质和未转染的质粒或病毒颗粒。

• 将细胞重悬于适量的 PBS 缓冲液中，加入 DiI 染料，按照 1:1000 的比例稀释，在 4°C 下避光孵育 15 - 30 分钟，以标记细胞膜。然后用 PBS 缓冲液再次洗涤细胞，去除未结合的 DiI 染料。

• 对于表达 GFP 的细胞，直接将细胞悬液进行流式细胞仪检测；对于其他外源基因表达的细胞，加入相应的荧光抗体，按照 1:500 的比例稀释，在 4°C 下避光孵育 30 - 60 分钟，然后用 PBS 缓冲液洗涤细胞，去除未结合的荧光抗体。

2. 流式细胞仪检测参数设置

• 使用 FACSVerse 流式细胞仪（BD Biosciences）进行检测。首先，通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）对细胞群体进行初步筛选，排除细胞碎片和聚集物。

• 设置 DiI 染料的荧光检测通道（如 FL3 通道），检测细胞膜的荧光信号，以区分活细胞与死细胞。对于 GFP 或其他荧光标记的外源基因表达产物，分别设置相应的荧光检测通道（如 FL1 通道用于 GFP），调整合适的电压和补偿参数，以确保能够准确检测到荧光信号并排除背景干扰。

• 采用双参数或多参数分析模式，同时检测细胞的荧光强度和细胞数量，以获取细胞群体中不同荧光强度亚群的分布情况。

（四）数据统计分析

1. 数据采集
   使用流式细胞仪配套的软件（如 BD FACSDiva 软件）采集细胞的荧光信号数据，包括每个细胞的荧光强度、细胞数量以及不同荧光通道之间的相关性等信息。

2. 数据分析

• 将采集到的数据导入到专业的数据分析软件（如 FlowJo）中进行进一步分析。首先，通过绘制荧光强度直方图，确定荧光阳性细胞的比例，即表达外源基因的细胞占总细胞数的百分比，作为基因转移效率的初步评估指标。

• 采用双变量或多变量分析方法，分析不同荧光通道之间的相关性，例如 DiI 与 GFP 荧光强度之间的关系，以排除非特异性荧光信号的干扰，提高检测的准确性。

• 对于多组实验数据，采用统计学分析方法（如 t 检验或方差分析）比较不同实验组之间基因转移效率的差异，以评估不同转染或转导条件对基因转移效率的影响。

三、结果

（一）细胞活率与膜标记

（二）基因转移效率检测

1. 质粒 DNA 转染
   以 GFP 表达质粒转染 HeLa 细胞和 HEK293 细胞为例，在转染 24 小时后，通过流式细胞术检测到表达 GFP 的细胞群体。在 HeLa 细胞中，GFP 阳性细胞比例约为 30% - 40%，而在 HEK293 细胞中，GFP 阳性细胞比例相对较高，可达 50% - 60%。随着转染时间的延长至 48 小时，GFP 阳性细胞比例在两种细胞系中均有所增加，表明基因表达水平逐渐升高。

2. 病毒载体转导
   使用慢病毒载体转导 HeLa 细胞和 HEK293 细胞时，在转导 48 小时后即可检测到较高比例的外源基因表达细胞。以某一特定外源基因（非 GFP）为例，通过荧光抗体标记后，在 HeLa 细胞中，该外源基因阳性细胞比例约为 40% - 50%，在 HEK293 细胞中可达 60% - 70%。与质粒 DNA 转染相比，病毒载体转导在基因转移效率方面表现出更高的效率和更稳定的表达水平。

（三）检测方法的准确性与灵敏度

1. 准确性验证
   为了验证新型流式细胞术检测方法的准确性，将本方法与传统的 qPCR 方法进行对比。在对同一批转染细胞样本进行检测时，两种方法所测得的基因转移效率结果具有良好的相关性（R² > 0.9）。然而，本方法能够直接反映细胞水平的基因表达情况，而 qPCR 方法检测的是基因转录水平，可能存在转录后调控等因素导致的差异。

2. 灵敏度评估
   通过对低表达水平的外源基因进行检测，评估新型流式细胞术检测方法的灵敏度。结果表明，该方法能够检测到低至 1% - 2% 的荧光阳性细胞，明显优于传统流式细胞术检测方法（通常最低检测限为 5% - 10%），能够更灵敏地检测到低表达水平的基因转移事件。

（四）不同转染 / 转导条件的影响

1. 转染试剂浓度
   在质粒 DNA 转染实验中，研究了不同浓度的 Lipofectamine 2000 转染试剂对基因转移效率的影响。结果显示，随着转染试剂浓度的增加，基因转移效率呈现先上升后趋于平稳的趋势。当转染试剂浓度过高时，可能会对细胞产生毒性作用，导致细胞死亡和基因转移效率下降。

2. 病毒感染复数（MOI）
   在病毒载体转导实验中，改变慢病毒载体的 MOI 值，观察其对基因转移效率的影响。随着 MOI 值的增加，外源基因阳性细胞比例逐渐升高，但当 MOI 值过高时，可能会出现病毒载体的过度感染，导致细胞状态异常和基因表达不稳定。

四、讨论

（一）多参数分析

（二）高灵敏度

（三）高通量检测