骨相关疾病分享专题（二）——空间蛋白质组学和空间代谢组学成像

一．骨关节炎疾病背景：

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是最为常见的关节退行性疾病，也是一种以进行性软骨破坏、软骨下骨异常代谢及滑膜慢性炎症为特征的全身性疾病。在我国，膝骨关节炎的发病率约为8.1%，随着人口老龄化加剧，这一数字预计将持续攀升，已成为威胁中老年人生活质量的重要健康问题。该疾病的本质是机械应力与生物学因素相互作用导致的关节组织失衡，其发病机制复杂，涉及机械磨损、炎症反应、细胞代谢异常及遗传易感性等多重机制的交叉影响。

从病理生理学角度来看，骨关节炎的核心病变主要体现在四个关键环节：

① 首先是关节软骨的进行性磨损，表现为软骨细胞外基质（如Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖）的降解与丢失，导致关节面毛糙、裂痕产生，甚至软骨层全层剥脱，暴露出下方的软骨下骨。这一过程主要由金属蛋白酶（如MMP-13）和聚集蛋白聚糖酶（ADAMTS-5）的过度激活所驱动。

②软骨细胞在异常应力或炎症因子（如IL-1β、TNF-α）的持续刺激下，发生异常分化、衰老甚至凋亡，同时分泌大量的炎症介质和基质降解酶，进一步破坏软骨稳态。

③其次是骨赘的形成，即关节边缘的异位成骨。这种现象被认为是关节系统在力学稳定性丧失后的一种代偿性修复反应，但这些新生的骨赘反而会限制关节活动、加剧疼痛。第三个病理特征为软骨下骨的异常骨代谢。由于软骨磨损导致关节受力分布改变，软骨下骨区域出现骨吸收增强或骨硬化等异常改变，进一步影响软骨的营养供应和力学支撑。

④最后是滑膜的增生与炎症浸润，主要表现为滑膜巨噬细胞的异常活化与纤维母细胞增生，形成慢性滑膜炎，释放更多的炎症因子，从而形成“炎症-破坏-更重炎症”的恶性循环。

在疾病分类上，骨关节炎可分为原发性与继发性两大类。原发性骨关节炎多与年龄、遗传、肥胖等系统性因素相关，呈现缓慢进展的退行性过程；而继发性骨关节炎则具有明确的病因，如关节创伤、先天性畸形、代谢性疾病或长期重体力劳动等。临床上，患者常表现为关节疼痛、僵硬、活动受限及关节畸形，尤其在负重活动后症状加剧，严重影响行走、上下楼梯等日常活动。

综上，骨关节炎作为一种高发性、进展性的关节疾病，其复杂的病理机制及多重表型特征使其成为骨科、运动医学及再生医学领域的重要研究方向。从基础到临床，从分子到组织，多维度探索其发病机制与治疗策略，对于改善患者预后、减轻社会医疗负担具有显著的科研与临床意义。

二．空间蛋白质组学和空间代谢组学成像平台：

空间蛋白质组学：

    空间蛋白质组学（Spatial Proteomics）是一种革命性的高通量生物技术，它在传统蛋白质组学的基础上，突破了只能提供整体蛋白质表达谱的局限，通过结合高分辨率空间成像与蛋白质分析，实现在组织或细胞样本中保留原始位置信息的前提下，对成千上万种蛋白质进行精准鉴定、定量及功能解析。作为现代生命科学的前沿领域，这一技术致力于揭示蛋白质在复杂生物系统中的空间分布模式、动态变化及其与微环境相互作用的机制，从而为疾病诊断、治疗靶点发现和精准医学提供前所未有的深度视角。其核心在于解决组织异质性问题——例如，在肿瘤组织中，癌细胞、免疫细胞、基质细胞等形成高度结构化的微环境，不同区域的蛋白质表达和功能可能截然不同，进而影响疾病的发生、发展和治疗响应。例如，在癌症研究中，肿瘤核心区域与侵袭边缘的蛋白质谱可能存在显著差异，影响免疫逃逸或药物敏感性。

    空间蛋白质组学的技术实现主要依赖于两大路线：一是基于质谱成像的方法，如基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI），它通过激光扫描组织切片，直接检测蛋白质或多肽的质量信号，并结合空间坐标重建其分布图；这种方法无需特异性标记，能覆盖广泛的蛋白质种类，但空间分辨率相对有限（通常为几十微米），且对低丰度蛋白质的检测灵敏度有待提升。另一主流技术是基于多重荧光抗体标记，例如成像质谱细胞术（Imaging Mass Cytometry, IMC）或CODEX（Co-Detection by indEXing）等，它们利用抗体与目标蛋白质结合，并通过荧光或金属标签进行信号放大和多重检测，从而实现单细胞或亚细胞水平的高精度空间映射。这些方法通常需要优化抗体组合、标记策略和图像分析算法，以消除背景噪声并确保数据的可重复性。这些技术的进步离不开跨学科融合，包括显微镜技术、质谱学、生物信息学和计算生物学。在数据分析层面，空间蛋白质组学涉及复杂的生物信息学流程，包括图像配准、信号去卷积、蛋白质定量和空间聚类分析，以识别与疾病相关的生物标志物或功能模块。

空间蛋白质组学的应用领域极为广泛：

• 在肿瘤生物学中，它能够揭示肿瘤微环境中免疫细胞浸润的空间格局、细胞间通信网络以及信号通路的区域性激活，这些发现对于开发靶向疗法或免疫治疗策略至关重要，例如，通过分析PD-L1蛋白在肿瘤细胞与T细胞交界处的分布，可以预测免疫检查点抑制剂的疗效。

• 在神经科学中，该技术可用于解析大脑不同区域的蛋白质组成，帮助理解神经退行性疾病如阿尔茨海默病的病理机制，其中淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结的空间分布模式，可能影响认知功能的衰退速度。

• 在发育生物学中，空间蛋白质组学可以追踪胚胎形成过程中蛋白质表达的时空动态，从而阐明器官发生和细胞分化的分子基础。

技术发展历程中，早期的免疫组织化学虽能提供空间信息，但通量有限；随着高通量技术的成熟，如近年来的单细胞空间蛋白质组学，它结合了单细胞分离技术和多重抗体标记，实现了从宏观组织到微观细胞水平的无缝衔接。当前，该技术正朝着更高分辨率、更高通量和更低成本的方向发展，例如结合人工智能进行自动图像识别和模式预测，以加速生物标志物的发现。

空间代谢组学成像平台

空间代谢组学成像平台（Spatial Metabolomics Imaging Platform）是一类用于在保留原始空间位置信息的前提下，对生物组织切片中的内源性代谢物（如脂质、氨基酸、糖类、有机酸等）进行原位检测、鉴定、定量和可视化分析的综合性技术系统。

其核心价值在于能够直接揭示代谢物在组织微环境（如肿瘤组织、脑部区域、植物根部等）中的特异性分布、丰度变化及相互作用，从而将代谢表型与特定的病理或生理空间区域直接关联，为理解疾病机制、发现生物标志物和开发靶向疗法提供独特视角。目前主流的平台技术有基于质谱的成像技术（Mass Spectrometry Imaging, MSI）：这也是目前最主流和广泛应用的技术。

MALDI-MSI（基质辅助激光解吸电离质谱成像）：这是最成熟的平台之一。其工作流程包括：制备新鲜冷冻或FFPE组织切片 → 在切片表面均匀喷涂基质（Matrix） → 利用激光逐点轰击样品表面，使代谢物发生解吸电离 → 通过质谱检测器分析每个像素点（pixel）中代谢物的质荷比（m/z）和强度 → 最终根据所有像素点的信息重构出特定代谢物在整个组织切片上的空间分布图像。其优势在于检测范围广（能覆盖上千种代谢物）、灵敏度较高，但空间分辨率通常限制在10-50μm级别，且基质喷涂可能引起代谢物的人为位移。

总之，空间代谢组学成像平台通过将代谢物的化学信息与其在组织中的空间坐标完美融合，极大地推动了从“组织平均水平”到“空间异质维度”的代谢研究范式转变，已成为生物医学研究和新药研发中不可或缺的强大工具。

三．骨关节炎相关疾病中运用空间蛋白组学和代谢组学的应用场景

Integrative spatially resolved proteomic and metabolomic imaging reveals synovitis endotypes implicated in osteoarthritis progression

期刊：Theranostics        发表时间：2025      影响因子：13.3

研究背景：

本研究立足于骨关节炎作为一种涉及整个关节的复杂炎性疾病这一现代认知，聚焦于其中至关重要却异质性极高的病理过程——滑膜炎。传统上，OA被视为单纯的软骨退行性病变，但越来越多的证据表明，滑膜的炎症是驱动OA疼痛和结构进展的核心因素。然而，滑膜组织在空间上存在显著的病理异质性，不同区域可能同时处于静止、血管增生或纤维化等不同状态，这种“同病不同相”的特点使得传统批量检测方法无法揭示其精确的分子演进规律，严重阻碍了有效的靶向治疗策略的开发。因此，本研究旨在通过开发创新的空间多组学成像技术，在分子层面精确解析滑膜炎的不同功能内型，以期揭示其从微血管病变到纤维化的动态发展轨迹，为OA的精准分型和靶向治疗提供全新的理论基础。

研究方法：

实验方案设计：

1.样本收集与处理

-从接受全膝关节置换术的OA患者中获取滑膜组织。

-选取两个代表性区域进行后续分析。

-组织经冷冻切片（10 μm），进行Masson三色染色用于形态学评估。

2.空间蛋白质组学分析

-激光捕获显微切割：在200 μm × 200 μm的网格中对滑膜组织进行切割，共获得390个“体素”。

-蛋白质提取与消化：使用DMSO收集体素，经TEABC缓冲液溶解，Trypsin/Lys-C混合酶解。

-微流液相色谱：采用5 cm C18柱，15分钟梯度，实现高通量（~90样本/天）分析。

-质谱分析：使用Bruker timeTOF flex，DIA-PASEF模式进行蛋白质鉴定。

3.空间代谢组学成像

-MALDI-MSI：在相邻切片上进行，空间分辨率20 μm。

-基质：使用NEDC作为基质，覆盖低m/z范围的能量代谢物。

-代谢物鉴定：基于HMDB数据库，质荷比容忍度10 ppm。

4.数据分析

-蛋白质数据处理：使用DIA-NN进行数据库搜索，UMAP降维，K-means聚类。

-代谢物数据处理：使用SCILS Lab进行图像对齐、标准化和统计分析。

-共表达与通路分析：使用mfuzz算法识别共表达模块，clusterProfiler进行GO富集分析。

-相关性分析：使用Pearson/Spearman方法分析蛋白质标志物之间的相关性。

主要研究结果：

1.识别出四种滑膜炎功能内型

通过空间蛋白质组学聚类分析，将滑膜分为四个功能阶段：

Cluster 1：静止期-代谢沉默，炎症因子表达低。

Cluster 2：微血管病变期-高表达vWF、ENG，提示内皮功能障碍和血管生成。

Cluster 3a：前纤维化期-血管与纤维化共存，TGF-β通路激活。

Cluster 3b：后/活动性纤维化期-高胶原沉积，表达MMP3、HSPA1A、POSTN等纤维化标志物。

2.构建伪时间轨迹

揭示了从微血管病变→ 前纤维化 → 纤维化的连续发展过程。

强调了TGF-β通路和代谢重编程在纤维化转化中的关键作用。

3.代谢组学揭示能量代谢紊乱

在纤维化区域中，脂肪酸氧化、TCA循环、糖酵解相关代谢物显著上调。

关键代谢酶（如HADHA/B、CPT2、PDHA1）表达升高，支持代谢炎症在OA中的作用。

4.共表达模块分析

识别出四个共表达模块，分别富集于：

• 血小板聚集、凝血

• TGF-β信号、成纤维细胞活化

• 脂代谢、纤维蛋白溶解

揭示了微血管血栓形成与纤维化之间的分子联系。

5.标志物相关性分析

• 在纤维化阶段，血管标志物（vWF、VCAN）与成纤维细胞标志物（POSTN、THY1）显著相关。

• 血小板活化标志物（如THBS4）与纤维化调节因子（TGFBI）在纤维化阶段相关性增强。

  
  

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