在线拉曼光谱仪应用之基于拉曼光谱的没食子酸甲酯化反应在线监控方法

常用的反应监测方法包括滴定、高效液相色谱、薄层色谱、气相色谱等。这些检测方法，通常需要对样品进行复杂的前处理，且检测时间长，难以满足反应过程监测与控制要求。近年来，近红外光谱、拉曼光谱、核磁共振波谱等过程分析技术逐渐应用于化学反应过程实时监测，及时获取反应动力学、形态变化、反应终点时间、反应物和产物质量浓度等信息。

酯化反应过程中有水生成，逐渐由有机相体系转变为水体系。水分子是一个较差的拉曼散射体，使用拉曼光谱检测水体系中的有机官能团振动是较为方便的；近红外光谱则会受到水的强烈影响，在水体系中进行其他成分的鉴定和定量较为困难。

另外，核磁共振波谱使用成本较高。

利用激光与物质分子相互作用产生的、具有“指纹”特性的拉曼散射光谱，通过专门设计的工业探头和系统，在工艺流程中原位、实时地获取光谱信息，并借助化学计量学模型将其转化为精确的组分浓度数据，最终实现生产过程的连续监控与智能控制。

由上海如海光电科技有限公司提供的在线拉曼光谱仪。

2.1 没食子酸甲酯化反应与实验装置 

没食子酸甲酯化反应的化学反应方程式(图 1)为：

实验装置示意图如图 2 所示。向四颈烧瓶中加入定量甲醇和没食子酸(按工业生产等比例缩小)，升温溶解后降至常温，在控温条件下滴加浓硫酸，升温至反应温度，回流 6 h。

2.2 拉曼光谱采集 

由于反应体系具有强酸性和腐蚀性，插入式探头容易被腐蚀，因此采用流通池结构实现光谱对反应体系的在线检测，即通过蠕动泵使烧瓶中的溶液泵出，溶液流经流通池，经探头检测后，流回烧瓶。探头与反应溶液之间用石英流通池隔开，探头由金属模块固定。其中，到达流通池前经过的管路长 68 cm，按流速 14 mL·min_x0010_ 1 计算测量时滞约 88 s，与 6 h 的反应时间相比，可以忽略该时段内反应溶液的变化，因此满足在线监测要求。拉曼光谱采集参数为：光谱范围 172.91~3201.75 cm- 1，激光强度500mW，积分时间 20 s，平均次数 3 次，每张光谱采集间隔时间为0 s，每组实验可采集 351 张光谱。在不同反应温度下进行 3 组实验，共采集 1053 张光谱。 

2.3 参考值分析 

使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法分析反应过程中没食子酸质量浓度。每组实验中，0~1 h 每 5 min 取样一次，1~3 h 每 10 min 取样一次，3~5 h 每 20 min 取样一次，5~6 h 每 30 min 取样一次，每次取样 400 μL，冷却至常温后用水稀释 125 倍，得供试品溶液。每组实验33个样品，3 组实验共 99 个样品。 色谱柱 Agilent Zorbax SB-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相 A 为甲醇，流动相 B 为 0.05%(体积分数)磷酸-水溶液，采用梯度洗脱程序：0~10 min，5% A~10% A；10~26 min，10% A~30% A；26~27 min， 30% A~80% A；27~37 min，80% A~80% A。流速为 1 mL·min_x0010_ 1 ，进样量为 5 μL，柱温为 25 ℃，检测波长 269 nm。按上述色谱条件进行方法学考察：没食子酸检测质量浓度在 0.016 6~2.076 2 mg·mL?1时，与峰面积相关系数R2为 0.999 86；精密度的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为 0.20%；重复性的 RSD 为 0.56%；没食子酸低、中、高质量浓度平均加样回收率为 101.09%，RSD 为 0.81%；48 h 内稳定性的 RSD为 0.73%。

2.4 校正模型建立 

以甲醇为溶剂配制 19 个质量浓度为 2.985 0~208.032 3 mg·mL?1 的没食子酸对照品溶液，流速设定为14.0 mL·min?1 ，每个质量浓度的对照品溶液测定 3 张拉曼光谱，共计获得 57 张光谱。使用 Unscrambler X 10.4 软件对基线进行基线偏移和线性基线校正，以减少实验过程中仪器和环境造成的不可预测的变化；使用 Savitzky-Golay 平滑法进行平滑处理，多项式阶数设为 3，窗口宽度设为 13。以一元线性回归方法和偏最小二乘(partial least squares，PLS)回归算法建立没食子酸甲酯化反应过程中拉曼光谱与没食子酸浓度的定量校正模型。使用决定系数 R2 、校正均方根误差(RMSEC)和验证均方根误差(RMSEP)对模型进行评价。

3.1 光谱特征峰分析

将一定量的没食子酸和没食子酸甲酯粉末溶于甲醇中，测得的拉曼光谱如图 3 所示。没食子酸的特征峰在 702.7、792.6 和 957.5 cm_x0010_ 1 ，没食子酸甲酯在 747.9 和 916.3 cm- 1 处有明显的特征峰。

3.2 校正模型的建立 

使用 Origin 2019b 软件对拉曼位移分别为 702.7、792.6和 957.5 cm_x0010_ 1 这 3 个形态较好的没食子酸特征峰，以峰高为 x，没食子酸质量浓度为 y，进行线性回归，求得标准曲线，计算其 R2 和 RMSEC，如表 1 所示。结果表明，没食子酸的检测质量 浓度在 2.985 0~208.032 3 mg·mL- 1时，与特征峰相对强度表现出良好的线性关系，R2 均大于 0.999，且重复性良好，满足定量要求。间隔选取 7 个对照品溶液分别在 18.5 和 9.5 mL·min?1 流速下测定 3 次拉曼光谱，使用上述的线性回归模型进行预测，考察流速对光谱测量系统的性能影响。

结果如表2 所示，RMSEP 均小于 3 mg·mL- 1。因此，流速对光谱测量系统的性能影响极小，在 9.5~18.5 mL·min?1 的流速范围内可以忽略。

3.3 没食子酸甲酯化反应过程监测

进行没食子酸甲酯化反应，流通池内溶液流速设定为 14.0 mL·min- 1 。以校正模型对没食子酸质量浓度进行预测。将预测值与 HPLC 分析得到的质量浓度值进行比较，评估模型性能如表 3 所示。反应温度为 65、70、75 ℃时，线性范围内分别有 32、33、30 个样品用于预测。

没食子酸甲酯位于 747.9 和 916.3 cm- 1 处的特征峰，对没食子酸位于 792.6 和 957.5 cm?1 处的特征峰影响较大，因此预测结果不佳。没食子酸 702.7 cm- 1 处的特征峰受干扰较小，具有较好的预测能力，且在 65~75 ℃，RMSEP 均小于 3.4 mg·mL?1 。

不同波段建立的模型，R2均大于 0.9995，RMSEC均小于线性回归模型的RMSEC；在不同反应温度下 RMSEP 差别较大，模型预测性能不佳。

一般来说，PLS 模型使用范围较宽的波段进行建模，可以提取光谱中更多的隐藏信息，但在该反应中建模效果不佳。可能是由于本实验中使用没食子酸对照品溶液进行建模，PLS 模型未掌握没食子酸甲酯相关信息。因此在没食子酸甲酯特征峰的干扰下，无法做出精准的预测。

综上所述，针对不同反应温度的没食子酸甲酯化反应，由没食子酸对照品溶液拉曼光谱建立的线性回归模型，相对于PLS 模型，具有更好的预测性能。

以拉曼位移为 702.7 cm- 1 处的特征峰高对 65、70 和 75 ℃反应温度下没食子酸质量浓度进行预测(图 4)，预测结果与 HPLC 分析得到的变化趋势基本吻合，RMSEP 分别为 3.248 3、3.3143和3.175 6 mg·mL- 1 。

以 3 个特征峰波段进行 PLS 建模，结果如表 4 所示。

以反应温度为 75 ℃下获得的预处理后的 351 张拉曼光谱图(局部)为例，说明反应物和产物特征峰随反应时间的变化情况(图5)。没食子酸的特征峰随反应的进行，相对强度逐渐降低；没食子酸甲酯的特征峰则随反应的进行，相对强度逐渐升高，符合化学反应规律。

以拉曼光谱数为横轴，相对强度为纵轴，绘制不同反应温度下，拉曼位移 702.7 cm_x0010_ 1 处没食子酸特征峰相对强度随时间变化的曲线图(图 6(a))。为了更直观地观察反应速率随时间的变化，使用 Unscramber 软件计算一阶导数并进行 Savitzky-Golay 平滑处理(图6(b))，多项式阶设为 2，窗口宽度设为 13。反应初始阶段，反应温度为 75 ℃时反应速度最快，70 ℃次之，65 ℃时反应速度最慢，因此温度越高，反应越快；反应中后期，温度越高，反应则越快达到平衡状态，反应温度为 75 和 70 ℃时，较 65 ℃更快趋近于反应的平衡状态。

本研究采用在线拉曼光谱对没食子酸甲酯化反应过程进行监测。结果表明，特征峰高的变化趋势可用于反映反应进程。使用一系列质量浓度的没食子酸对照品溶液建立线性回归模型，与 PLS 模型相比，对没食子酸质量浓度有更好的预测能力。将该模型用于反应在线监测，可以达到实时获取反应浓度的目的。

在本研究中，反应容器到流通池的管路长度和液体流速决定了响应时间，如海光电的浸入式探头可防腐蚀，探头在硫酸、盐酸、硝酸、氟化氢等强腐蚀性体系中均适用，可避免反应的滞后时间。对于更加复杂的反应，可能出现难以寻找特征峰或特征峰相互干扰严重的情况，灵活应用光谱预处理方法和多变量分析技术手段，可以提高光谱信息挖掘能力。