基因组DNA文库构建必备实验技巧
- 上传人： 上海恒远ELISA试剂盒供应商 |大小：29KB|浏览：1737次|时间：2018-11-16
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基因组DNA文库构建必备实验技巧基因组DNA文库用途十分广泛,如用于人类及动植物基因组学研究,基因表达调控研究,分析、分离特定的基因片段等.通常情况下,基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞.一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问,高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的.需要通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法,在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解,同时也要尽量保证DNA的纯度.二、处理基因组DNA根据研究目的,研究者需要选择合适的载体.不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求,必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库.比如,对于黏粒载体,合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体,合适的片段长度平均为120kb-300kb.构建黏粒基因组DNA文库,需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA,可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段,随后使用胶回收试剂盒回收DNA.构建BAC基因组DNA文库,需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoRI、BamHI或者HindIII）来消化基因组DNA,然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb）,随后透析回收DNA.需要注意：（1）电泳时,要选用合适的DNALadder,以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA.（2）电泳以后,应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间,否则会显著降低克隆效率.（3）回收DNA的时候,应该要避免过度离心,以防止DNA被剪切,降低文库质量.三、载体的选择目前,常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）.选用何种载体可以参考如下几个因素：1、目标区域的大小：如果基因组的目标区域很小（小于50kb）,那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体.利用现有的商品化的黏粒载体、GX率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株,可以方便的构建黏粒载体文库.如果基因组的目标区域比较大,那么P1、PAC或者BAC就比较合适了.P1操作比较困难,PAC相对简便.BAC载体也是很好的选择,可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库,比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒.如果目标区域非常大（大于250kb）,那么YAC载体就是了.不过,应用YAC载体来构建基因组文库,操作非常繁琐困难.表1各种载体的比较载体容量（kb）宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化2、筛选文库的难易程度：黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选,但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费.大容量载体文库,如P1、PAC、BAC、YAC,以二维阵列保存,既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选,又可以用PCR进行多克隆的群体筛选.而且,使用高容量载体构建文库,可以减少染色体步查的步骤.3、载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时,克隆DNA会发生重组,从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈.对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统,CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点.单拷贝载体能提高插入片段的稳定性,而且能在诱导剂的作用下,即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA.四、将基因组DNA片段连接入载体使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体.许多商业化载体已经经过预处理,可以直接使用,无需内切酶消化及脱磷酸化处理.选用连接快、效率高的连接酶,连接反应体系以100μl为宜.注意：BAC载体连接完以后,需要将连接产物做脱盐处理,除去连接反应缓冲液里的盐分.五、将重组载体转入宿主细胞如果构建黏粒文库,需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物,测定包装好的黏粒克隆的滴度,然后转染.挑出重组子,鉴定插入片段的大小.如果文库的大小和质量都令人满意的话,就可以铺板进行文库筛选,或者扩增、保存文库.如果构建BAC文库,应选择电转法,将上述连接产物转入受体菌,涂板长出克隆.获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估,确定文库大小是否能够满足要求.如果文库大小合适,就可以进行后续操作了.六、文库克隆数的确定基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性.一般使用如下的经验公式来确定：N=ln（1-P）/ln（1-f）P是希望得到的覆盖率,f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,N是所需的克隆数.举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,人类基因组大小为3x109bp,插入片段大小为100kb,希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为N=ln（1-0.99）/ln（1-[106bp/3x109bp]）=138,298技术支持资料：材料缓冲液和溶液-碱裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）配制碱裂解液I约100ml,灭菌,保存在四度.-碱裂解液II,新鲜配置,室温保存0.2NNaOH（从10N的NaOH新鲜制备）1%（w/v）SDS碱裂解液II应该新鲜配制,室温保存.-碱裂解液III,4°C5M醋酸钾,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-异丙醇-酚：氯仿（1：1,v/v）-醋酸钠（3M,pH5.2）-STE,4°C10mMTris-Cl（pH8.0）0.1MNaCl1mMEDTA（pH8.0）-TE（pH8.0）10mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）载体与菌株BAC转化的大肠杆菌培养基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基酶和缓冲液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性内切酶和相应缓冲液核苷酸/寡核苷酸用于脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）的DNA标准参照物凝胶/点样缓冲液脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgels,或者0.5%琼脂糖凝胶）离心机/转头/离心管其他37摄氏度摇床1.BACDNA大量提取方案（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以产生20-25μg纯化的DNA.方法1.将50μlBAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中,37℃震荡（280rpm）培养12到16小时.2.2500g,4℃,离心15min,收集菌体.3.用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀.按步骤2方法离心收集细菌.4.用24ml含RNase（100μg/ml）的碱性裂解液I溶解细菌.加溶菌酶至终浓度为1mg/ml.5.加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II.盖紧离心瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,冰裕5min.6.加入24ml冰预冷的碱性裂解液III,盖紧瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,置冰上5min.7.15000g,4℃,离心10min,将上清转移到另一离心瓶中,弃沉淀.8.加等体积的酚：氯仿.轻轻翻转离心瓶数次,混匀.3000g,室温离心15min.9.将水相移至另一离心瓶中,加入等体积的异丙醇,翻转离心瓶数次,混匀.10.15,000g,室温离心15分钟,回收核酸沉淀.11.弃上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.弃乙醇,风干使乙醇挥发殆尽.13.小心将BACDNA沉淀溶于0.2mlTE（pH8.0）中.2.BACDNA的小量提取（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从5ml菌液中提取BACDNA,一般可以产生0.1-0.4μg的BACDNA.方法：1.挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中,37℃剧烈震摇过夜.2.2000g,4℃,离心5min,收集菌体.3.在每个离心管中加5ml预冷的STE,用移液器吹悬细菌沉淀.按步骤2离心收集细菌.4.将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中.将菌体转移至预冷的微量离心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II.轻轻翻转数次,将离心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III,轻轻翻转数次.将离心管置于冰上5min.7.在微量离心机上以Zda速度4℃离心5min,除去细胞碎片沉淀.将上清移入一新的微量离心管中.室温下加入900μl异丙醇,轻轻翻转数次离心管,混匀.8.立即在微量离心机上室温下Zda速离心5min,使核酸沉淀.弃去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室温下离心2min,吸去乙醇.室温干燥沉淀5-10min后,将沉淀溶于50μlTE（pH8.0）中.
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