单细胞筛选系统常用单细胞分选方法

       单细胞筛选系统是一种用于生物学、农学领域的分析仪器。单细胞分选仪可以在显微镜直接观察下，根据细胞形态学，荧光标记或位置，从贴 壁，悬浮和三维细胞培养系统，快速精确采集感兴趣的单细胞或细胞团。本仪器可 以在实验室常规使用的细胞培养器皿上直接采集细胞。

       单细胞筛选系统常用单细胞分选方法：

       1.有限稀释法 

有限稀释法是一种常用的单克隆培养方法，也可用于获取单个细胞。其原理主要是基于细胞悬浮液中细胞的分布及浓度进行计算，逐步稀释细胞悬浮液，最 终达到一定体积中只存在单个细胞。为了提高单细胞获得率，需要尽可能地进行稀释，在统计学上，以每单位0.5-0.9个细胞为宜。

优点：操作简便，无需特殊仪器设备，成本低。

缺点：对于浓度的计算易存在误差，基于泊松分布原理，即使在理想状态下，单细胞比例也只有约1/3，假阳性率高。

       2.显微操作法 

显微操作法是通过镜检，对单个细胞进行人工挑选的方法。在制备好适宜浓度的细胞悬浮液后，可置于显微镜下观察，利用口吸管（可由玻璃毛细管拉制而成）将目标细胞吸取出来。条件允许的话，还可使用显微操作仪，该仪器对口吸管、注射仪、毛细针有一定的固定、调节功能，可在一定程度上增加操作的通量以及稳定性。在生殖领域相关的研究中，多采取显微操作法获得单个细胞。 

优点：仪器设备要求不高，可准确获取形态完整的活性较高的单细胞。 

缺点：对操作人员技术要求高，有人为因素干扰，通量较低。 

       3.流式细胞分选 

如果对通量要求较高，同时目标细胞有适宜的荧光标记，可利用流式细胞仪完成单细胞分选。经荧光染色或标记的单细胞悬液，被高压压入流动室内，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。通过相应荧光检测及充电，获得目的细胞，实现单细胞分离。进行免疫方面的研究时，流式细胞分选为首 选分离方法。 

优点：通量较高，可分选单个细胞。 

缺点：需要具有分选功能的流式细胞仪，有稳定可用的荧光标记或荧光染料，需制备一定量的细胞悬浮液，不适用于微量样本。  

       4.激光显微切割 

激光显微切割适用于组织样本的细胞分选，组织切片经染色后，在显微镜下进行观察，锁定目标区域，利用激光进行切割、分选。某些型号的仪器还可以直接进行活体组织的细胞切割分选（如Leica LMD7000），无需先制备冰冻切片。 

优点：可对组织样本进行细胞分选，可结合免疫组化信息。 

缺点：需要激光显微切割平台，操作较复杂，包括固定染色等步骤，对核酸产生潜在的损害。 

       5.微流控分选 

微流控分选基于流体力学原理实现细胞分选，适用于高通量、大规模的单细胞研究。近两年大热的10x Genomics ChromiumTM就平台就是利用微流控技术进行单个细胞分选，其技术核心是含有75万种Barcode的油滴包裹的凝胶珠（GEMs），能在10分钟内自动完成多至80,000个细胞的捕获，目前广泛应用于细胞分群相关的研究中。

优点：分选通量高，成本低，采用商业化仪器操作简便。

缺点：对细胞悬浮液活性要求较高（至少＞85%），细胞总量要求较高，若采用Barcode+UMI扩增原理，无法检测全长转录本。 

       以上5种单细胞筛选系统单细胞分选方法，各有利弊，研究者可以根据不同的科研需求及样本情况进行选择。目前，要实现单细胞的分选，第 一步往往需要制备细胞悬浮液，对于流式细胞分选以及微流控分选来说，对细胞悬浮液的总量以及活性都有一定的要求。