鱼骨形混合器制备纳米脂质体及其膜流动性对脂质体形成的影响

微流控混合技术的引入为脂质体和脂质基纳米颗粒的制备打开了新的大门，这些技术可应用于实验室和工业规模。本研究证明了磷脂双层片段作为关键中间体在脂质体形成机制中的作用，该机制是通过在NanoAssemblr仪器的“鱼骨”几何通道中微流控混合形成的。脂质双层的流动性用探针N,N,N-三甲基-4-(6-苯基-1,3,5-己三烯-1-基)的荧光各向异性来表示，发现它是影响脂质和水相的乙醇溶液微流控混合形成的脂质体的最终大小的基本参数。饱和和不饱和脂质以及不同胆固醇含量的脂质被用于脂质体的制备，并证明了通过DLS分析，流动性的增加导致脂质体大小的降低。螯合脂质被用于CryoTEM观察脂质体和双层片段的精细结构。实验数据和理论计算结果与脂质膜胶束泡沫化理论吻合。

脂质体，基于脂质双层的自组装纳米颗粒，被广泛用于生物医学和生物技术目的。脂质体由一个或多个薄片组成，由磷脂双层和包围的小体积的水溶液组成。脂质体的直径可以从几十纳米到数百微米不等，这取决于它们的制备方法。平均大小约为80纳米的单层或寡层脂质体通常被生产和用于药物输送系统。

脂质体膜的主要成分磷脂和脂质，在各种有机溶剂中溶解性良好，因此目前大多数方法使用有机溶剂(如甲醇、乙醇、叔丁醇、氯仿、醚类)将脂质溶解为整个过程的第一步。如果有机溶剂与水混溶，脂质体可以通过将脂质的醇溶液与水相混合来制备。乙醇注射法和前脂质体-脂质体法是实验室和工业规模中已建立的技术。

微流控技术的出现为脂质体和其他脂质基纳米颗粒的片上制备打开了一扇新的大门。 微流控技术已经证明了其控制有机相和水相混合过程的能力，因此，最终脂质体产品所需的参数，如尺寸、多分散性、形态和层状结构，可以以更可重复的方式实现。

各种系统被设计和建造用于实验室使用，也用于该技术在工业规模上的应用。脂质体生产的微流体方法是基于各种几何形状的混合通道的应用以及剪切力、电场或通道中发生的各种微流体效应的应用。Carugo et al.8, Wang et al.和Maeki最近发表了一篇综合综述。描述决定脂质双层圆盘形成脂质体的动力学和热力学参数的理论模型被描述。微流体混合过程可以帮助优化方法，特别是最近证明的利用复杂芯片技术进行工业规模生产的方法。

我们使用具有“鱼骨”几何形状的微流体混合通道在毫秒和纳升反应体积内进行纳米沉淀。混合通道的“鱼骨”几何形状将此过程与基于微流体水动力流动聚焦的微流体混合过程区分开来，后者是通过两个水缓冲液流来聚焦酒精流。

目前，“鱼骨”几何混合通道已经作为商业产品与计算机控制仪器一起用于脂质和聚合物纳米颗粒的实验室和工业规模制备。因此，该方法可广泛用于制备纳米脂质体。在鱼骨通道中进行微流控混合制备脂质体的示意图如图1所示。

在本研究中，我们应用螯合脂质和冷冻电子透射显微镜来详细观察脂质体的结构、脂质体膜和整个过程中形成的中间体。我们测试了脂质膜流动性对脂质体最终形态的影响，表现为尺寸分布、多分散性和层状。基于脂质膜流动性的精确测量(荧光偏振)，我们预测了该参数对盘状胶束中间体临界尺寸的影响，从而预测了它们囊泡化和形成脂质体的趋势。实验数据与基于Helfrich弯曲能模型的理论预测以及囊泡形成的能量学和热力学分析进行了比较。

微流控混合技术是生产复杂脂质体制剂和芯片技术应用的有前途的技术。钆配合物被用作MRI造影剂，脂质体是钆在体内成像和诊断学发展中应用的多功能平台。钆脂质配合物也是通过冷冻TEM观察脂质结构的有用工具。

微流控混合过程中脂质体形成机制的知识对于实验室和工业规模的工艺优化都非常重要。各种形式的双层磷脂片段(BPF)被认为是脂质体形成过程中的中间体。例如，碟状双层胶束(DBM)是洗涤剂去除方法过程中形成的中间体，这些碟状胶束的囊泡化产生了尺寸分布非常均匀的脂质体。另一方面，堆积双层片段是脂质体前体-脂质体方法中形成的主要中间体。由于微流控混合方法应用于脂质体的制备是基于类似的原理，如脂质体前体-脂质体方法或乙醇注射方法，因此有理由假设以DBM形式存在的BPF也是脂质体形成过程中的中间体。

双层膜胶束在水环境中的囊泡化是由于沿着膜胶束边缘的非极性疏水尾部暴露在极性水分子中的线张力能量最小化而驱动的自发过程。囊泡化是平面双层膜向球形转变的过程，受到脂质膜弯曲阻力的阻碍。因此，只有当驱动力足够大时，才能克服相应的弯曲阻力。

囊泡的形成在毫秒内从单个两亲性脂质分子的小聚集物开始，到快速自组装过程中形成的圆盘状双层结构(图7A)。生长中的双层结构通常倾向于保持圆盘状构型，以保持整体线张力能处于最小值。在达到某一临界尺寸后，双层结构倾向于弯曲，以进一步降低线能(图7B,C)。最后，杯状结构闭合形成球形囊泡，如图7D所示。这一机制意味着囊泡的最小尺寸与圆盘胶束的最小尺寸有关。

从平面DBM到封闭囊泡的转变过程中线能的减少被膜弯曲能的增加所抵消。囊泡的大小取决于膜尺寸生长动力学，但有一个临界膜尺寸，低于该尺寸的囊泡化在能量上是不利的。这意味着在DMB临界直径以下的囊泡不会形成，这也暗示了囊泡的临界直径，它取决于决定脂质双层流动性/柔韧性的脂质组成。

胆固醇对微流控混合制备脂质体粒径分布的影响
在相同的制备条件下，流速比为3:1和总流速为7 ml/min，微流控混合制备的脂质体表现出不同的大小特性，这些特性取决于脂质的饱和/不饱和链和胆固醇含量。流量比(FRR)是指通过微流控通道混合的有机和水介质的体积比，总流量被定义为通过两个入口泵入的有机和水介质的体积比之和。

根据所需的组成将所需的单个脂质溶解在无水乙醇中，并分别以4 mg/ml的浓度溶解在EtOH:DMSO(1:1)的混合物中，用于组成2、3、4和1。使用NanoAssemblr台式仪器(Precision NanoSystems, Canada)在规定的流速比(FRR)为1:3和总流速(TFR)为7 ml/min下快速混合有机相和水相(Milli-Q水)，以形成1 mg/ml脂质的单层脂质体。在混合过程中，使用NanoAssemblr台式加热控制器附件(Precision NanoSystems, Canada)控制温度。为了制备含有DSPC的脂质体，分别将温度设置为65 °C。

图1，鱼骨通道微流控混合原理及脂质体的形成。有机水混溶溶剂(乙醇)含有形成脂质体的脂质，水相含有待封装的水溶性组分。混合过程在毫秒内完成，脂质体通过自组装机制形成。各种计算机控制的线性注射器泵用于驱动混合过程。

图2，胆固醇对由不饱和磷脂(EPC)制备的脂质体的大小、多分散性和各向异性的影响。(A)主轴上胆固醇浓度(mol%)与Z平均直径(nm)的关系图，小轴上DPH-TMA的稳态荧光各向异性。(B)主轴上胆固醇浓度(mol%)与Z平均直径(nm)的关系图，小轴上多分散性指数(PDI)的关系图。

图3，胆固醇对饱和磷脂(DSPC)制备脂质体的尺寸、多分散性和各向异性的影响。(A)主轴上胆固醇浓度(mol %)与Z平均直径(nm)的关系图，小轴上DPH-TMA的稳态荧光各向异性。(B)主轴上胆固醇浓度(mol %)与Z平均直径(nm)的关系图，小轴上多分散性指数(PDI)的关系图。

图4，随着胆固醇浓度从10 mol%增加到50 mol%，(A)EPC/胆固醇和(B)DSPC/胆固醇脂质体的数量大小分布。

图5，通过冷冻电镜和原子力显微镜观察脂质体的结构，脂质体由微流控混合法制备，组成为DSPC:Chol 70:30，冷冻电镜图(左)和原子力显微镜图(右)。

图6，脂质体的cryo-TEM图像：(A)对照样品(表1，组成3)，磷脂双层宽度≈4.3 nm，(B)含有5%的Gd-脂质的脂质体(表1，组成3)，磷脂双层宽度≈5.8 nm，(C)具有脂质膜片段的脂质体(表1，组成1)和(D)偶联脂质体。

图7，自组装过程中囊泡形成的示意图。一个平面圆盘状胶束(A)弯曲成一个球形帽(B和C)，最终闭合形成一个囊泡(D)。

图8，微流控混合脂质体形成过程中可能出现的稀有过渡中间体示意图。

图9，NanoAssemblr仪器设置，精确测量混合盒中的温度，并使用Zetasizer Ultra进行尺寸分布测量(A)，在NanoAssemblr微流控盒中微流控混合芯片的“鱼骨”结构的细节(B)。

参考文献：
Kotouček, J., Hubatka, F., Mašek, J. et al. Sci Rep 10, 5595 (2020).