基于原子薄等离子激元纳米材料的单相增强横向位移无标记生物传感

快速等离子激元生物传感在疾病早期诊断和分子生物学研究中具有重要意义，受到了广泛关注。然而，传统的角度询问等离子激元传感器在无二次放大标记（如等离子激元纳米粒子）的情况下，如何获得更高的灵敏度仍是一个挑战。

为了解决这一问题，该研究团队开发了一种基于相位奇点增强横向位移的等离激元生物传感器。这种奇点表现为共振等离激元基底反射暗点处的突然相位延迟，导致反射光束的巨大位移。本文首次证明了银纳米膜上的原子薄层Ge2Sb2Te5 (GST)是一种新型的相位响应增强等离子激元材料。GST层不仅可以精确地实现单相变化，而且还可以作为活性银纳米膜的保护层。在校准实验中，这种新结构实现了创纪录的最大位移439.3 μm，具有1.72×108nm RIU-1的超高灵敏度。其检测限限为6.97×10-7 RIU，位置分辨率为0.12 μm。

此外，对于这种位移询问，研究人员评估了4.54×1011 μm (RIU°)-1的大优值(FOM)，使痕量生物分子的无标记检测成为可能。在靶向生物传感实验中，优化后的传感器成功检测到最低浓度1×10-16M的小细胞因子生物标志物(TNF-α和IL-6)。这两种分子是临床诊断中关键的促炎性肿瘤标志物，目前的临床技术无法直接筛选。为了进一步验证本研究传感系统的选择性，研究人员还测量了整合素与精氨酸酰甘氨酸（RGD）肽在不同Mn2+离子浓度下的亲和力，范围从1nM到1mM。

与传统的角度/强度询问方法不同，这项工作利用横向位置位移来感知折射率的变化。这种横向位置位移可以在全内反射后的线偏振入射光束上观察到，这被称为Goos-Hänchen位移(GH位移)。在一定入射角下，通过对反射相位变化的微分推导出GH位移距离。等离子体基板上的这种位置位移可以从共振角的剧烈相位变化中明显放大。如图1a所示，由于p偏振光和s偏振光的相位不同，它们的反射位置被分开了。因为只有p偏振光作为垂直于传感衬底的电场振荡，才能诱发与表面等离激元的共振。共振等离子体界面引起的突然相位延迟只发生在p极化激发下。因此，p偏振光上的GH位移对折射率变化非常敏感，而s偏振光上的GH位移可以忽略不计。
图1：Principle and optical setup of singular phase enhanced plasmonic sensor
a 使用银gst传感衬底的传感器头的原理图。入射光通过棱镜耦合到传感基板上，激发表面等离子体激元。p偏振光和s偏振光之间的横向位置位移差表示为ΔGH。在谐振角θR处，反射的p偏振光发生巨大的横向位置位移，该位移对折射率变化很敏感。b 用于测量从传感器头反射的p偏振光和s偏振光横向位置的设置。入射光的波长在785 nm和633 nm之间可切换
图3：Differential GH shift enhancement reflects the phase singularity from topological darkness
a, b银和银- gst衬底之间的差异GH位移的比较。(a)的Y轴以对数绘制。(b)中的GH位移曲线从负向正翻转，以便更好地进行比较。c, d在785 nm (c)和633 nm (d)处计算的相位差(实线曲线)与反射率(虚线曲线)的对比。

如图3a, b所示，通过相位的微分可以直观地看到拓扑黑暗中的相位奇异，其形式为GH位移(Eq. 1)。在785 nm激发的银gst衬底上，可以发现奇异相位跳变引起的差分GH位移的巨大峰。在633 nm处，计算出的GH峰位移为7930.4 μm，是银衬底和银- gst衬底的100倍以上。此外，银- gst衬底的GH峰宽度(FWHM)达到0.001°，比单独使用银衬底的GH峰宽度(0.203°)窄了200多倍。此外，最大生长激素信号比目前的具有更复杂纳米结构的生长激素传感衬底(例如，连续统中的准束缚态和石墨烯，迄今为止尚未得到实验验证)高一个数量级和窄一个数量级。
图4：Sensitivity characterization of fabricated sensing substrates with glycerin solutions.
a 在传感基板上加载样品的微流控系统原理图。活动注入通道用黄色标记。b甘油溶液在785 nm银gst底物上诱导GH位移的实时测量。c, d在785 nm (c)和633 nm (d)处，传感器对银和银- gst衬底上GH位移的响应随折射率变化。标记值是在1%甘油溶液中测量到的最大位移。用同一批甘油溶液测量传感器响应。误差条表示3次重复实验中GH位移的变化

如图4a所示，构建微流控系统，实现样品的批量测量，用于灵敏度表征和进一步的生物标志物靶向实验。该系统包括一个微流体流量控制器(OB1 MK4, Elveflow Inc.，法国)，一个开关阀(MUX DISTRIB, Elveflow Inc.，法国)，一组四个样品储液池和一个连接到传感基板的流动池。微流控流动池体积为200 μL。通过安装在样品储液池和微流体流动池之间的开关阀来选择样品。流量控制器OB1 MK4提供的注入压力为15mbar。
图5：Detecting adsorbable small molecules
a l-丙氨酸在银- gst底物上吸附的实时测量。b l -丙氨酸吸附10分钟后传感器响应的线性拟合。c生物素在PBS中的实时吸附测定。d生物素吸附20 min后传感器响应的线性拟合。这些传感器图是在785 nm激发下获得的。误差条表示吸附测量最后一刻测量到的GH位移的变化

传统的角度/强度询问式SPR传感方案难以检测浓度小于1pm的小分子(< 1kda)。在这项工作中，我们展示了在低浓度下用银gst底物在785 nm下检测l -丙氨酸和生物素。由于这个演示是直接吸附生物分子，新的注射将冲走一些弱结合分子(特别是低浓度分子)。连续稀释的l -丙氨酸在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中从10 fM到10 nM的传感器响应如图5a, b所示。l -丙氨酸在10 fM吸附20分钟后的差异GH位移测量为13.7 μm。浓度每增加一个数量级，l -丙氨酸诱导的生长激素差异位移增加2.106 μm。
图6：Specific cytokine detection with immobilized antibodies
a, b传感器图显示肿瘤标志物tnf - α (a)和IL-6 (b)在785 nM的银gst底物上从0.1 fM到1 nM的实时检测。c用于癌症标志物检测的GST表面功能化示意图。d吸附20分钟后tnf - α和IL-6的传感器响应比较。误差条表示吸附测量最后一刻测量到的GH位移的变化。e, f非特异性和特异性抗原在同源抗体上的吸附。e TNF-α和IL-6标记物在TNF-α抗体功能化传感器上的吸附。f IL-6和TNF-α标记物在IL-6抗体功能化传感器上的吸附

我们进一步演示了对癌症标志物的检测，以显示所演示的生物传感器的临床潜力。肿瘤坏死因子α (TNF-α， 17.3 kDa)和白细胞介素-6 (IL-6, 20.9 kDa)是两种不同的肿瘤标志物。肿瘤标志物的测量基于相同的银gst底物，用于甘油校准和小分子检测，操作波长为785 nm。为了获得肿瘤标记物的稳定结合，用APTMS将一层标记物抗体固定在GST表面(图6c)。APTMS可以通过羟基锚定在GST表面，而相反的胺端可以促进抗体的吸附。

我们还研究了整合素和RGD三肽之间的结合动力学，以证明我们的银- gst传感底物的多功能性。整合素的亲和力受多种因素的调节，包括但不限于二价阳离子的浓度、细胞骨架的机械张力和调节蛋白的结合(细胞收缩性)。在本演示中，我们专注于通过增加缓冲液中Mn2+浓度来实时监测亲和力增强。

与用于免疫分析的功能化方案类似，RGD接枝共聚物PLL-PEG-RGD (PLL-g-PEG/PEG-RGD, SuSoS，瑞士)通过硅烷连接剂-(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTES;图7a和S4)。由于PLL- peg - rgd的聚l -赖氨酸(PLL)骨架具有大量带正电的胺基，因此固定化MPTES上的负巯基有利于其在传感器表面的吸附。通过细胞扩散实验证实了RGD接枝共聚物在GST底物上的吸附作用，以及MPTES的吸附促进作用。如图7b所示，将三种gst包被的底物与成纤维细胞(WPMY-1细胞)孵育半小时。左上角未处理，中间仅用PLL-PEG-RGD功能化，右上方同时用MPTES和PLL-PEG-RGD功能化。平均有82%的细胞在MPTES和PLL-PEG-RGD功能化的底物上扩散良好，表明功能化质量优于仅经PLL-PEG-RGD处理的底物(51%)和未经处理的底物(22%)。因为通过整合素附着细胞的比例与移植RGD肽的密度呈正相关。
图7：Monitoring the binding kinetics of integrin-embedded proteoliposomes to RGD peptide.
a 用于癌症标志物检测的GST表面功能化示意图。b显微镜照片显示成纤维细胞附着在GST表面和RGD/MPTES功能化的GST表面。c整合素包埋的蛋白脂质体在RGD功能化银- gst底物上的结合动力学，在缓冲液中不同Mn2+浓度下测量。黑色直虚线是传感器在Mn2+ free buffer中的响应基线。彩色虚线和下面的黑色曲线分别表示蛋白质脂质体结合和解离过程的指数拟合。d整合素包埋蛋白脂质体与RGD肽的可观察结合常数(Kobs，橙色线)和解离常数(Kd，蓝色线)随Mn2+离子浓度的变化。误差条表示绑定常数的95%置信区间

Mn2+诱导亲和增强的证明是基于整合素嵌入的蛋白脂质体而不是细胞的测量。通过将纯化的αIIbβ3整合素重组为脂质体，我们可以从细胞环境中分离出整合素，并独立研究其结合动力学。图7c给出了10 μg mL−1的蛋白脂质体在缓冲液中不同Mn2+浓度(1 nM ~ 1 mM)下的缔合和解离过程的传感器图。Mn2+浓度的增加有利于蛋白脂质体的吸附，且移动曲线更高。

来源：
法国特鲁瓦工程技术大学的Shuwen Zeng及其研究小组与香港中文大学的Ho-Pui Ho等人合作并取得一项新进展。经过不懈努力，他们实现基于原子薄等离子激元纳米材料的单相增强横向位移无标记生物传感。

Zhu, S., Jaffiol, R., Crunteanu, A. et al. Label-free biosensing with singular-phase-enhanced lateral position shift based on atomically thin plasmonic nanomaterials. Light Sci Appl 13, 2 (2024). https://doi.org/10.1038/s41377-023-01345-6