EPICENTER提供了五种不同的EZ-Tn5™pMOD™转座子构建载体*,用于制备定制的EZ-Tn5转座子(表1)。每个载体均包含一个多克隆位点(MCS),其两侧是由EZ-Tn5转座酶特异且**识别的19 bp多活性末端(ME,用表示)。为了制备转座子,将任何感兴趣的DNA序列(例如选择标记,控制元件,报告基因)克隆到MCS中,然后通过PCR扩增或限制性内切酶消化产生转座子。任何转座子构建载体均可用于生成EZ-Tn5转座子,但它们具有不同的功能。
转座子构建载体PMOD-2 和PMOD-3 ORI / MCS>是基于pUC的载体。它们由ME序列组成,这些序列位于带有colE1复制起点的载体中MCS的侧面(图1)。EZ-Tn5的PMOD-3 ORI / MCS>还包含一个R6Kγ ORI 的ME序列内,这对于各种抢救克隆应用是有用的。这些载体在大多数情况下都能很好地构建转座子。但是,如果转座子是通过限制性内切酶消化制备的,则未切割的pMOD载体就有可能污染构建的转座子。
为了解决这个问题,colE1 ORI 被淘汰在PMOD-4 和PMOD-5 ORI / MCS>,它仅具有R6Kγ ori的 从这两个新载体中的R6Kγ起点复制取决于 TransforMAX™EC100D™ pir + 和 pir -116 大肠杆菌细胞产生的 pir基因产物 。由于大多数细菌菌株不包含 pir 基因,污染这些转座子制剂的未切割质粒DNA无法复制,从而消除了背景问题。
EZ-Tn5™ pMOD™-5 Transposon Construction Vector 好处说明
MCS可以轻松克隆任何目标DNA。
使用EZ-Tn5转座酶在MCS侧翼的多活性19 bp马赛克末端序列进行高效转座。
转座子两端的独特引物结合位点,可使用正向和反向测序引物(另购)对插入位点进行双向测序。无需设计自己的底漆。
可以使用三个选项来准备用Pvu II消化EZ-Tn5转座子 ,用Psh A I 消化 或使用载体随附的PCR引物进行PCR扩增。
EZ-Tn5™ pMOD™-5 Transposon Construction Vector 图例说明
图1(单击放大)。EZ-Tn5™pMOD™转座子构建载体的功能。
Figure 1 (click to enlarge). Features of the EZ-Tn5™ pMOD™ Transposon Construction Vectors.
图2(单击放大)。EZ-Tn5转座子™构建载体PMOD™-2 和 PMOD™-3 ORI / MCS>复制在标准 大肠杆菌使用复制的colE1原点菌株。 与PMOD由转座子™-3 ORI / MCS>载体还具有R6Kγ ORI座子内,救援克隆应用。
Figure 2 (click to enlarge). EZ-Tn5™ Transposon Construction Vectors pMOD™-2 and pMOD™-3ori/MCS>replicate in standard E. colistrains using a colE1 origin of replication. Transposons made with the pMOD™-3ori/MCS> vector also have an R6Kγoriwithin the transposon, for rescue cloning applications.
图3(单击放大)。EZ-Tn5转座子™构建载体PMOD™-4 和 PMOD™-5 ORI / MCS>缺乏复制的colE1起点和要求 大肠杆菌产生一个菌株 PIR 基因产物进行复制。 当通过限制性核酸内切酶消化制备人工转座子时,这导致来自未切割质粒DNA的背景较少。
Figure 3 (click to enlarge). EZ-Tn5™ Transposon Construction Vectors pMOD™-4 and pMOD™-5ori/MCS>lack a colE1 origin of replication and require E. colistrains that produce a pir gene product for replication. This results in less background from uncut plasmid DNA when an artificial transposon is prepared by restriction endonuclease digestion.
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pMOD™-2 | colE1 | None |
pMOD™-3ori/MCS> | colE1 | R6Kγori |
pMOD™-4 | R6Kγori | None |
pMOD™-5ori/MCS> | None | R6Kγori |
pMOD™-5ori/MCS> | colE1 | None |
*The use of Transposome™ complexes for in vivo insertion of a transposon, including, but not limited, to HyperMu™ and EZ-Tn5™ Transposome™ complexes, is covered by U.S. Patent No. 6,159,736 and related patents and patent applications, exclusively licensed to EPICENTRE.