应用｜使用Gilson pipetmax 从全血中全自动分离血浆的经济型应用

在本应用中使用了标准带盖保护罩的PIPETMAX（图2），装配单个移液头及一个用于96孔板的标准托盘。使用TRILUTION? micro v3.0 软件运行方法程序。

图2 Gilson桌面型液样工作站PIPETMAX? 

本应用使用了一个4x1200的移液头。较大容量的吸嘴可以更有效地将稀释液分配至目标管中，同时也能够将样品管中的血浆准确地按所需的体积转移。 

4×1200移液头使用Gilson PIPETMAN? DIAMOND D1200吸嘴（如有需要，也可以使用DF1200ST 无菌过滤吸嘴）。在该配置中，吸嘴的间距为18 毫米，非常适合用于血浆检测的典型样品管。例如，典型的真空采血管外径为16毫米。

8 道移液头吸嘴的间距为9毫米，过于窄小，因此上述配置相比使用8道移液头更为高效。 

由于本应用不需要第二个移液头，因此PIPETMAX移液头支架的左侧安装了一个“空白”头。

本应用使用了PIPETMAX标准托盘（托盘布局参见图3），该托盘比适用于384孔板的托盘更为经济。PIPETMAX 托盘有九个SBS标准板位，其中一个位置专用于废弃吸嘴盒的放置；另一个位置放置了D1200吸嘴，即一盒96个吸嘴；第三个位置，放置了一个含稀释液的6道储液槽；最后六个位置由样品管和目标管占用（各占三个板位）。 

为适应所需的特殊工作流程，我们设计了两种定制管架。一种定制管架用于放置采血管(BD Microtainer? MAP microtubes)，单个管架可容纳24支采血管。第二种定制管架用于放置目标管(screw cap cryovials)，单个管架也可容纳24支采血管。样品管和目标管比例为1:1，可确保两者无误差排布。 

托盘上剩下的六个位置，可以用于样品管架和目标管架的放置，每种各三个。在PIPETMAX上，这相当于完整的两行，因此我们将三个样品管管架放置在托盘的中间行，三个目标管管架放置在托盘的最外面一行。由于每个管架可容纳24支管，这意味着每次运行可处理总共72个样品。

PIPETMAX 使用Gilson TRILUTION micro  v3.0  进行控制，运行的程序是使用Gilson  Protocol   Builder   v2.1 编写。

为了使移液参数的优化尽可能简便，运行程序在编写时即引入了多个变量。在TRILUTION micro软件运行时就可以调整这些变量的设置，而无需每次都编写新的程序。这有助于程序的快速优化，允许用户在实验室中“动态”调整参数，无需编程操作。

图4展示了在程序编写过程中设置的变量，该程序包括稀释和混合步骤，以及从样品管中转移上层血浆的步骤。在这里我们可以看到，吸液、排液和排空的流速可以进行调整，样品数也可以进行调整。在混合步骤中，混合次数和混合时吸取的体积也可以作为变量进行调整。

图4 变量的优化

使用 PIPETMAX，可以运行多种程序，这些程序可以包括完整的工作流程，也可以将工作流程中的一部分保存为单独的程序进行使用。本篇应用中的完整移液程序，第一步是从储液槽中吸取1260μL的稀释液，并转移到指定的冻存管中。这一步使用了Protocol Builder软件中的“Transfer”，“Deliver from Pool”移液命令。在这一步骤中，参数设置了使用同一吸嘴吸取和转移液体，直到该步结束时更换吸嘴。尽管操作体积超过了该移液头/吸嘴组合的最大容量， PIPETMAX 会自动将该体积均分，分两步完成了操作。

在将稀释液转移至冻存管内后，第二个步骤是从每个样品中移取 140μL 上清液至冻存管内。这个步骤也是一个移液命令，但用了“stamp transfer”命令，并设置了参数，强制 PIPETMAX在样品之间更换吸嘴，以避免样品之间的交叉污染。在移液命令设置的最后，选择了“mix”选项, PIPETMAX 完成样品转移步骤后，将立即使用相同的吸嘴将样品稀释液混合。除了将样品和稀释液混合之外，这一步还确保了在样品排出后，吸嘴上残留的任何液滴都被冲洗出来并进入冻存管中，从而提高了移液的精准性。 

从血液样品中移取血浆的困难之一是样品不一致。血液样品的成分会因不同个体而有差异。如果患者贫血，那么红细胞的含量相对于样品体积就会更低。其他基于患者的差异可能来自患者的健康状况，如水合水平、健康状况、性别、年龄、最近摄入的药物或酒精，以及接触的毒素或病毒。 

除了样品组成的可变性外，实验室收到的样品体积也可能存在差异。在采集血液样品时，通常使用真空管（vacutainer tube），该过程涉及使用真空将血液从体内抽入接收管中。真空抽吸获得的样品体积通常会存在一定差异。因此，在样品组成的可变性之外，还可能存在一定程度的体积差异。 

这种可变性可能导致一些样品不适合由 PIPETMAX 进行自动血浆采样。作为一种经济的解决方案，PIPETMAX 通过程序设定从样品管中定义的高度开始吸取血浆。这意味着所有样品管中至少需要有X体积的总样品，以便在编程高度有血浆可以吸取到PIPETMAX的吸嘴中。一旦抽吸开始，PIPETMAX会通过软件标准自带算法控制，使吸嘴跟随液位下降。在这种情况下，X的数值将根据收到的样品按照实验室的需要来确定。

需要考虑差异性的另一部分是在吸取所需体积时，起始点和红细胞层之间是否有足够的血浆。可以通过基于红细胞需要低于一个可定义为Y的体积来更好地考虑这一点。

总的来说，如果红细胞的体积小于体积 Y，且总样品体积大于体积 X，则该样品适合使用 PIPETMAX进行移液（见图6）。由于血液样品是放置在相同的采血管中的，因此可以合理地根据管内的高度估算这些体积，而无需测量体积。可以通过眼睛估算管内的高度，仅需配合定制管架来辅助就能可视化判断。

为了最佳优化工作流程，离心分离红细胞和血浆后，在取出样品管时应当进行适当样品的筛选。任何被认为不适合的样品都需要单独考虑。有些样品可能红细胞含量较高，总体积较低，这可能导致样品中没有足够的血浆来获得所需的体积。在这种情况下，没有任何移液方法能解决问题，必须使用较小的样品体积进行工作，或者提出需要更多的样品；有些样品管则可能含有过多的样品，导致血浆充足但红细胞体积过大，超出可接受范围。这些可以筛选出来并手动处理，或者如果这类样品足够多，可以在PIPETMAX 上运行另一个使用不同吸取起始位置的替代程序。