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解决方案
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如何在 SpectraMax iD5 和 i3x 微孔读板 机上优化 Transcreener TR-FRET 检测
发布:美谷分子仪器(上海)有限公司浏览次数:766介绍
Transcreener HTS 是一种通用的,高通量的生化测定平台,该测定法是基于核苷酸 (ADP) 的检测,核苷酸可由数千种激酶催化形成,其中很多激酶的催化共价调节反应对细胞的信号传导至关重要,并作为靶标在药物发现中具有重要价值。TranscreenerTR-FRET 测定法是一步竞争 性免疫测定法,可直接检测带有远红荧光标记的核苷酸的荧光信号。该测定
法是基于时间分辨荧光的共振能量转移 (TR-FRET) 的原理。该测定体系中使用的是与高特异性单克隆抗体 - 淬灭剂偶合
物结合的远红示踪剂,在紫外范围 ( 约 330 nm ) 激发铽 (Tb)配合物会导致其能量转移到示 踪剂,并在更高的波长 (665
nm) 产生发射光。目标酶产生的二磷酸或单磷酸核苷酸置换了与抗体链接的示踪剂,导致 TR-FRET 降低 ( 图 1)。使用
红色示踪剂可最大程度地减少荧光化合物和光散射的干扰。Transcreener TR-FRET 测定法是专为 HTS 设计的,采用一
步添加,混合和读取的测定模式。优势
• 一步添加,混合即读取的测定形式,非常适用于高通量筛选
• 使用远红示踪剂和时间分辨荧光技术,将荧光化合物的干扰降至最小
• 使用 10 μM ATP 在 10% 的转化率下达到出色的数据质量 Z′> 0.7验证要求
实现 Transcreener HTS 分析优势的一个关键因素是获取数据的酶标仪的正确设置,是否正确选择仪器设置 ( 包括滤光片和其他组件 ) 可能会影响仪器对任何给定测定的灵敏度。通过运行 10 μM ATP/ADP 标准曲线 (24 次重复 ) 来确定
Transcreener HTS 检测性能的关键仪器参数,并使用该标准曲线模拟酶促反应。从 10μM 浓度的 ATP 开始, ADP 的量慢慢增加,ATP 的量则按比例的减少,使腺嘌呤核苷酸总浓度保持在 10 μM。调整闪光次数来实现 Z′ > 0.5 的质量要求。如果 ATP 在 10% 的转化率下能达到 Z′ 值> 0.7,则表明该仪器能够用于 Transcreener TR-FRET 检测。材料
• Transcreener ADP2 TR-FRET Red Assay (cat. #3011-1K)
• ATP/ADP 组合液 : 10 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 0.01%Brij-35 and ATP/ADP ( 结合成恒定的腺嘌呤浓度 10 μM )
• ADP 检测混合液 : 1X Stop and Detect Buffer C, 8 nM ADP2Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer
• High FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate,26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect BufferC, 10 μM ATP
• Low FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate,26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect BufferC, 10 μM ADP
标准曲线制备
1. 在 384 孔 板的整 行中分配 10 μL 的每种 ATP/ADP 组合浓度的组合液。
2. 在这些行中加入 10 μL ADP 检测混合液。
3. 将 10 μL 的 10 μM ATP/0 μM ADP 组合液分配到 P 行。4. 将 10 μL 的 High FRET 混合液分配到 P1-P12 孔中。
5. 将 10 μL 的 Low FRET 混合液分配到孔 P13-P24 中。
有关制备标准曲线的详细步骤,请参阅相应的 Transcreener技术手册 (https://www.bellbrooklabs.com/technicalresources/technical-manuals/)。
微孔板读板机
• SpectraMaxiD5 多功能酶标仪(Molecular Devices cat, #ID5-STD),配备以下组件:
• TRF 增强模块 (Molecular Devices cat.#0200-7030)
• 滤光片 320/100 ( 可由 Molecular Devices 提供 )
• 滤光片 616/10 (Molecular Devices cat. #6590-0118)
• 滤光片 665/10 (Molecular Devices cat. #6590-012)
• SpectraMax i3x 多功能酶标仪(Molecular Devices cat, #I3x),配备以下组件:
• HTRF 检测卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011)仪器设置
SpectraMax iD5 和 SpectraMax i3x 读板机结合 SoftMax Pro数据采集和分析软件, 使用优化的设置继续执行以下步骤:
1. 打 开 SoftMax Pro 软件,“ 读数模式“ 选择 TR-FRET,”读数类型“ 选择 Endpoint; 在 SpectraMax i3x 读板 机上,光学配置选择 HTRF ( 卡盒 )。
2. 在 SpectraMax iD5 读板机上,安装 320/100 激发滤光片以及 616/10 和 665/10 发射滤光片,然后从激发和发射下
拉波长菜单中选择这些滤光片。在 SpectraMax i3x 读板机上,安装 HTRF 卡盒,当选择 HTRF 作为光学配置时,波长
将自动选择。3. 根据要检测的微孔板选择微孔板的“ 类型 ”,待测的微孔板区域选择“ 读数区域 ”。
4. PMT 和选项设置:将每次读取闪烁 ( 或每次读取脉冲 ) 设置为 20 到 100 ( 本文应用程序中设置为 50 ),测量延迟设
置为 0.05 ms,积分时间设置为 0.7 ms。
5. 针对每批新的微孔板或所使用的测定体积,zui好优化微孔板位置和读板的高度。只要体积,微孔板批次,示踪剂和浓度保持不变,相同的仪器设置可用于后续板的读取。 表 1 总结了上述设置。结论
在本文中,我们验证了使用 SpectraMax i3x 和 iD5 多功能读板机进行 Transcreener ADP2 TR-FRET 测定过程中表现出的优越性能,通过使用优化设置,可以达到 Z′ 值 > 0.8 ( 表 2 )。对于这两种仪器,在 2% 或更高的 ATP 转化率下都达到了高于验证标准 0.7的 Z′ 值 ( 图 2 ),超过了在 10% ATP 转化下 Z′ 大于 0.7 的最低验证要求。2022-04-26相关仪器 -
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