利用基于 HTRF 的 Tag-lite 技术检测胰高血糖素 GLP-1 受体的 Kd 值

导言
Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平台能够有效地用 HTRF 荧光团标记目标位点上感兴趣的蛋白。细胞表面受体可以插入 SNAP-tag 质粒中，然后用这种结构转染细胞并表达标记的受体。通过添加 snap -lumi4-Tb 底物，用铽 (Tb)穴状化合物标记受体。为了进行结合试验，受体的配体用 HTRF 受体荧光团标记，例如 d2。当 d2 配体与铽标记的受体结合时，可以使用具备 HTRF 功能的微孔板读板机检测受体到配体的时间分辨荧光共振能量转移 (TRFRET) ( 图 1)。

Cisbio 提供了多种标签和兴趣蛋白标记编码的质粒，以及已经用这些结构物转染的冷冻细胞。该结构体能够表达标记蛋白，如受体，可以用铽标记，同时其受体配体( 激动剂或拮抗剂 ) 用受体荧光团标记。Tag-lite 平台适用于广泛的应用，如受体二聚化、配体结合分析和第二信使评估。结合动力学可以研究药物 - 蛋白质复合物的结合和解离速率，是优化候选药物体内疗效的必要步骤 1。

优势
• 提供可靠的，免洗的饱和结合实验
• Cisbio HTRF 平台提供多种配置实验和试剂的选项
• 已有经过认证的 HTRF 仪器，确保仪器性能

胰高血糖素样肽 -1 受体 (GLP1R) 在Pancreatic cells中表达，其激活刺激腺苷酸环化酶途径，导致胰岛素合成和释放增加。因此，GLP1R 被认为是治疗糖尿病的一个潜在靶点 2。GLP1R 也在大脑中表达，它参与控制食欲，并在记忆和学习机制中具有潜在的重要作用。
在这里， 我们展示了如何使用 SpectraMax i3x 和SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机使 用 HTRF 进 行可靠的、免洗饱和结合分析。使用 Tag-lite 技术在 HTRF认证的 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上评估 GLP1R 配体的结合。
饱和结合实验
配体结合实验是评估特定配体与受体亲和力的重要手段，也是理解受体和配体相互作用机制的关键。结合研究因此成为药物发现过程的一部分，有助于设计出高选择性和特异性结合靶标药物。结合活性决定了单个生物分子之间的结合作用，如受体及其配体 ( 如激动剂 )。它通常用饱和分析来检测，用平衡解离常数 (Kd) 来表示。Kd用于评估配体与其靶标之间的相互作用强度并对其作用强弱程度进行排序。Kd 值越小，配体与靶标的结合亲和力越大。在竞争或抑制研究中，选择合适的配体浓度是准确测定 IC50 和抑制常数 (Ki) 的必要条件。一般来说，浓度达到或略低于 Kd 值是可以接受的。使用高于 Kd 值的配体浓度会使药物看起来不如它们在体内的效力。饱和结合试验检测总结合和非特异性结合浓度增加的配体 ( 图 2 )。荧光配体滴定到含有固定数量标记细胞的溶液中，孵育至平衡。当荧光配体与受体结合时，TR-FRET发生，并通过 HTRF 认证的微孔板读板机进行检测。得到的 HTRF 比率代表总结合。非特异性结合方式作为阴性对照，其使用未标记的配体进行检测，说明已标记的配体与受体、非受体分子或微板的非特异性结合 2。检测时，将荧光标记的配体滴定到含有固定数量标记细胞和 100 倍摩尔浓度的未标记配体的溶液中。标记的和未标记的配体竞争与标记的 GPCR 结合。由于非特异性配体过多，它会与受体结合，所以不会发生 TR-FRET。从这种滴定法得到的 HTRF 比率代表非特异性结合。通过从每个荧光标记配体浓度的总结合减去非特异性结合来计算特异性结合。

材料：
• Tag-lite GLP1R 表达，Tb 标记的冷冻细胞 (Cisbio cat.#C1TT1GLP1)
• Tag-lite 缓冲液 (Cisbio cat. #LABMED)
• GLP1 受体红色激动剂 (Cisbio cat. #L0030red)
• 毒晰外泌肽 4(Exendin 4，Sigma-Aldrich cat.# 1269105)
• 白色，低体积 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
• 带有 HTRF 检测卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011) 的 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices cat. #i3x)
• 带有 HTRF 检测系统 (Molecular Devices cat. #6590-0144, 包含增强型 TRF 模块及 HTRF 滤光片 )
方法
细胞
根据产品说明准备细胞，冷冻的细胞在 37℃ 解冻，转移到含有 5 ml 1x Tag-lite 缓冲液 (TLB) 的试管中。4℃，
1200g，离心 5 min。吸出上清液，重悬于 2.7 ml 的 1xTLB 中。
荧光标记配体
GLP1 受体红色激动剂是一种用红色荧光 HTRF 探针标记的 Exendin 4 衍生物。将原浆浓度稀释于 1X TLB 中制备
400 nM 浓度的红色激动剂 ( 原浆浓度见试剂盒说明书 )。10 个额外的 1:2 稀释，然后用 1X TLB 得到最终浓度从
100 nM 到 0.097 nM。
非标记配体
稀释原溶液到 1 x TLB ( 见产品说明 ) 制 备 40µM 终浓度无标记 Exendin 4 配体。这相当于最大标记配体浓度
400 nM 的 100 倍摩尔。

实验板设置
按照 Cisbio 配体结合说明书将试剂分配到板内 ( 图 3 )。384 孔白板孔内注入 10 µL GLP1 受体细胞，5 µL TLB 添加至总结和孔内，5 µL 未标记配体添加至非特异性结合孔中。最终，5 µL GLP1 受体激动剂 exendin 4- 红色标记物添加到所有孔中。将实验板在室温孵育 2 h 并用优化的仪器设置 ( 表 1 ) 在 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上读取。两个读板机都进行高度优化以确保最佳的实验灵敏度和动态范围。

数据分析
HTRF 分析涉及 Cisbio 的专利比率法，该方法基于检测到的两个发射波长。616 nm 处的供体发射光被用作内参，而 665 nm 处的受体发射光被用作测定生物反应 ( 结合 ) 的指示剂。这种比率测量 ( 受体与供体荧光的比率 )减少了孔间的变异，并消除了化合物干扰。在下面的步骤4 中计算的 Delta F，将信号去除背景，对于测定之间的比较是有用的。根据 665 nm / 616 nm 的比值计算结果，用 Delta F 表示如下 :

数据通过 SoftMax Pro 软件获取并分析，软件内已预置了 HTRF 的模板可以简要的检测和分析

结果
对总结合孔 和非特异性结合孔的每个标记配体浓度计算 HTRF 比率。通过从每个荧光配体浓度下的总结合减去非特异性结合计算特异性结合。如上文所述，对数据进行分析，并 使 用 SoftMax Pro 软件进行双直角双曲线拟合 ( 图 4 )，得出最佳结果，读数设置如表 1 所示。SpectraMax i3x 读板机产生的饱和曲线 ( 这里没有显示 )与 SpectraMax iD5 读板机类似。在特定饱和曲线中双直角双曲线拟合中拟合参数 B 为 Kd。Cisbio 建立了一个 5nM 或更低的 Kd 值，以确认酶标仪能够成功地测量带有红色受体的 Tag-lite 分析。SpectraMax i3x 读板机的 kd值为 0.816 nM, SpectraMax iD5 读板机的 kd 值为 2.347nM ( 表 2 )，证实了这两种仪器检测这些 Tag-lite 实验的能力。

讨论
SpectraMax i3x 和 iD5 读板机可分别配备 HTRF 检测卡盒或增强型 TRF 模块及滤光片，两种读板机都证明了它们能够
检测来自铽供体和红色受体组合的 HTRF 信号，并且它们可以使用 Tag-lite 技术进行饱和研究。使用带有预先配置的
HTRF 模板的 SoftMax Pro 7.0.3 ( 或更高版本 ) 软件简化了数据采集和分析。