细胞培养工艺未来发展新方向——来了解下连续灌溉培养吧

2020 年 9 月 28 日由生物制品圈主办的 2020 细胞免疫与基因ZL技术论坛在上海隆重召开。

会上来自不同企业、科研机构的嘉宾共同讨论细胞免疫ZL当前面临的挑战以及突破思路。

Eppendorf ZG生物工艺部门的技术专家解正刚先生在会上就细胞ZL和基因ZL技术中最重要的细胞培养工艺，做了技术分享和案例介绍。

不可或缺的细胞培养技术

无论是细胞ZL，还是基因ZL，都离不开细胞培养技术。

细胞可以作为ZZ的产品（如 CAR-T 细胞），也可以作为病毒载体的生产基质（如慢病毒、AAV 等）。

相对于传统的细胞批次培养，连续灌流培养更符合未来生物工艺的发展方向。在进行工艺设计中，工艺的可行性、流程和质量的可控性、合规性、成本这四个方面是ZZ实现产业化的前提条件。

基于这四个关键条件，解正刚先生从三个方面介绍了生物反应器采用培养细胞连续灌流技术在细胞ZL和基因ZL中的应用。

01 关于悬浮细胞和贴壁细胞的选择

由于单抗产业越来越成熟，悬浮细胞培养利用其可放大性得到很多行业的借鉴。

但在细胞ZL工艺中，类似于 MSCs 等细胞，很难驯化成悬浮细胞，因此，必不可免的，需要保留贴壁细胞工艺。

 悬浮细胞培养的优势和挑战 

02 不同的连续灌流培养工艺

针对悬浮培养和贴壁培养各自的优势和挑战，我们提出了不同的连续灌流培养工艺。

例如 hiPSCs 的细胞过滤灌流技术、Vero 细胞（溶瘤病毒制备）高密度培养微载体沉降系统（Decanter）、SF-9 制备杆状病毒载体的旋转过滤器（Spin-filter）系统、交替切向流细胞截留系统（ATF）等。

这些灌流系统进一步提高了悬浮或贴壁细胞的生产效率。

但对于大规模应用来说，不同的灌流系统存在成本高、易堵等挑战，研发人员在选择时需要进行全面的考量。

03 片状载体 — 篮式固定床灌流系统

除了上述的四种灌流系统外，解正刚先生还着重和大家分享了同时用于贴壁和悬浮细胞培养的片状载体—篮式固定床灌流系统。

该系统将搅拌式生物反应器技术和细胞固定技术的优势结合起来，让细胞进入片状载体的内部贴附生长，或于空隙内悬浮生长。

片状载体-篮式固定床系统示意图及流体力学图

实验组效果更显著

对于实验中分别使用 5x10⁵ cells/ml 的 293T 贴壁细胞和 293F 悬浮细胞进行接种，两种细胞接种后上清液均在 30 分钟内澄清，细胞迅速进入载体内部生长。

在培养 5-6 天后，两种细胞在反应器内均达到了 2.5x10⁷ cells/ml（工作体积），扩增了 50 倍。

同时，对照的采用 10L 一次性生物反应器培养的悬浮 293 细胞仅达到 5.0x10⁶ cells/ml。

实验组是对照组细胞密度的 5 倍。

293F/293T 细胞ZZ密度（x10⁷cells/ml）

提高生产效率、节约空间和使用成本

使用该方法进行慢病毒制备，可将病毒滴度由 HYPERFlask 里的 7.0 提高到 8.0 以上，连续灌流可以收获多至 6 个工作体积的病毒原液。

收获时间也比使用 HYPERFlask 最多 72 小时延长至 196 小时。

由于这种系统拥有超高的比表面积和细胞密度，让慢病毒生产可以在 20L 以下的反应器内进行，提高了生产效率，节约了空间和使用成本。

简化可行性论证

和传统搅拌式反应器一样，该系统也可以通过 tip-speed 和 P/V 的放大模式进行进一步的放大生产。

目前，这样的设备在国内外疫苗生产、EPO 生产、基因ZL载体的生产中都得到了验证，简化了细胞ZL工艺在临床申报中设备可行性的论证。

片状载体-篮式固定床反应器

按照贴壁面积和 10x 细胞工厂的比较

随着新技术的发展，工艺也在不断地发展和改进。

对于工艺开发来说，没有通用的zui好的工艺，只有最适合的工艺。

而这也是广大的工艺开发人员，一直在向前迈步的重要动力。