新技术！使用SEC-UV-MALS-RI技术分析rAAV颗粒滴度和实心率

腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV)是一种微小病毒，因其具有较强的感染细胞能力、低免疫原性和长时间的基因表达优势，被广泛应用在基因治疗中作为载体。基于这些特点，重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus，rAAV)成为最有潜力的基因转移载体之一。在rAAV制品中，核酸包裹在颗粒内部，但部分颗粒可能存在核酸装载不足的情况，需要准确的了解其的各项关键质量属性。

中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室李响及其研究团队在《药物分析杂志》发表了“应用SEC-UV-MALS-RI技术分析重组腺相关病毒(rAAV)的颗粒滴度和实心率”。文中介绍了一种新型表征方法（SEC-UV-MALS-RI），该表征方法是为AAV类样品量身打造的多检测器联用技术，无需任何假设和标准品校正即可快速、准确、高精度、高重复性地分析rAAV的摩尔质量、颗粒滴度和空包率（Cp/Vg）等关键质量属性，可作为rAAV制品质量控制的方法。

样品：重组5 型腺相关病毒(rAAV-F，批号NF200501)，重组5 型腺相关病毒空壳对照品( rAAV-E，批号NE200501，不含核酸)

分析仪器：SEC-MALS[MALS: DAWN, RI Detector：Optilab from Wyatt]

1. 摩尔质量结果

通过SEC-UV-MALS-Rl技术对rAAV的摩尔质量进行了测量。ASTRA软件利用光散射信号、示差信号和紫外信号对每个时刻洗脱出的rAAV进行复合物分析，如图1所示，可以看到rAAV-F和rAAV-E样品的角度激光散射信号与分子量洗脱曲线的叠加情况。在图2中展示了供试品rAAV-F、E1-F5、E2-F4、E3-F3、E4-F2、E5-F1、rAAV-E的摩尔质量洗脱叠加结果，同时指出随着混合样品中载体实心颗粒比例的降低，样本中核酸的分子占比也随之下降，平均核酸摩尔质量也随之降低。

图1 rAAV－F 样品和rAAV－E 样品18 角度激光散射信号与分子量洗脱曲线叠加图

图2 供试品rAAV-F、E1-F5、E2-F4、E3-F3、E4-F2、E5-F1、rAAV-E 的光散射图谱和摩尔质量洗脱曲线叠加图

2. 重复性结果、准确性及线性结果

5个混合样品的总颗粒滴度（衣壳蛋白颗粒数或衣壳浓度）测量结果见表1，结果重复性RSD均＜2%。实心颗粒滴度测定结果见表2，结果重复性RSD均＜3%。实心率（实心颗粒滴度/总颗粒滴度）结果见表3，结果重复性RSD均＜4%。根据分析结果，考察5 种混合样品的实测颗粒滴度及实测实心率与预期值的一致性，r均＞0. 99，见表4。

在准确性方面，根据准确性数据拟合直线，计算拟合直线剩余标准差( Sxy) 和拟合直线斜率，进而计算出检测限为0.56×10¹² vp·mL^－1，定量限为1.7×10¹² vp·mL^－1。综合来看，该新技术在分析重组腺相关病毒载体滴度和实心率方面具有较高的重复性、准确性和线性。

表1 供试品的总颗粒滴度测定结果

表2 供试品的实心颗粒( 基因组) 滴度测定结果

表3 供试品的实心率测定结果

表4 供试品的颗粒滴度和实心率预期值与实测值

SEC-UV-MALS-RI可以检测rAAV的颗粒滴度、实心率等重要参数，从而对其质量进行监控和评估。实验结果表明，通过该技术可以准确地测定rAAV的各项指标，为基因治疗等领域的研究提供了重要支持。此外，在系统校准方面，文中还讨论了对SEC-UV-MALS-RI技术的系统参数进行校准的重要性。

总的来说，该技术的应用为rAAV制品质量控制提供了一种准确可靠的方法，未来有望推动基因治疗领域的发展。目前，公司不仅提供优质的大分子表征仪器，还有全方位的应用方案支持，随时欢迎各位老师咨询。

编译：JL，CML，LYW-

分类：SEC-MALS

关键词：SEC-UV-MALS-RI、AAV、rAAV、颗粒滴度、空包率。

参考文献

［1］ GOSWAMI Ｒ，SUBＲAMANIAN G，SILAYEVA L，et al． Gene therapy leaves a vicious cycle［J］． Front Oncol，2019，9( 4) : 297

［2］ WU Z，ASOKAN A，SAMULSKI ＲJ. Adeno－associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy［J］． Mol Ther，2006，14( 3) : 316

更多文献请查看原文：doi: 10. 16155 /j. 0254－1793. 2023. 11. 05