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LI-600等应用案例 | 【Plant Science】保卫细胞中PIF4及 HY5的活性调控蒸腾

发布：北京力高泰科技有限公司

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文章标题

Guard cell activity of PIF4 and HY5 control transpiration

保卫细胞中PIF4及 HY5的活性调控蒸腾

https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2022.111583

作者 |Gilor Kelly等

翻译 | 王露

因译者翻译水平有限，详情查看原文

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便携式叶面积仪

LI-3000C

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摘要

植物的蒸腾作用涉及到植物水力学以及植物气孔运动相关背景。蒸腾过程会受到内源以及外界环境信号的调节，而在众多环境因子中，光起着主导作用。

光强，光质都会影响气孔孔径的大小。如何调控孔径让植物摄入CO2的量最佳，且如何让植物水分耗散量最小，这些问题值得思索。尽管光环境变量与蒸腾之间的关系已有深入研究，但在遗传层面，保卫细胞如何感知这些信号，以及感受信号之后又如何影响气孔导度，目前这部分研究有所局限。

而在该研究中重点关注两个关键的光响应转录因子HY5和PIF4，它们分别属于bZIP家族以及BHLH家族。该研究发现在拟南芥保卫细胞中过表达PIF4，会导致蒸腾作用降低，在pif4突变体中的表达甚至会抑制蒸腾作用。HY5在野生型拟南芥，烟草，以及hy5拟南芥突变体的保卫细胞中过表达，会提高蒸腾速率。此外，在拟南芥中发现HY5可逆转己糖激酶HXK1过表达导致的蒸腾速率降低的情形。

注

HY5（ELONGATED HYPOCOTYL5）

PIF4（PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR4）

HXK1（HEXOKINASE1）

1.研究背景

植物水分管理主要通过蒸腾作用进行调节，植物蒸腾会受到内源信号与环境信号共同调节，其中光起着主要的作用。当光出现时，光信号会刺激叶片气孔打开并且会启动叶片与大气之间的日常气体交换。光在一天中持续影响植物气孔导度，进而影响每天的气体交换速率（H2O以及CO2的扩散）。

光质也会影响气孔的开闭。气孔打开大多是由单色蓝光启动，较小程度上由红光和远红光启动，在红光背景中添加蓝光可增强昼夜气孔导度，但与单独使用红光相比，会阻碍整体水分利用效率。为响应光环境变化，植物的蓝光与红光受体接收到相应信号会控制气孔运动以及气孔导度，该过程的下游元件调控的遗传学背景，主要来源于幼苗光形态建成阶段的研究。一些参与光信号转导的转录因子被证明是光形态发生中的关键节点，比如光敏色素相互作用因子PIF。

PIF类因子在光信号感知以及信号转换中起到重要的作用。而PHYB（PHYTOCHROME）是PIF的上游调节因子，通过调节气孔密度以及气孔导度，减少水分流失，进而提高植物的耐旱性。突变体Phyb相比野生型植株而言气孔更加闭合，而突变体pif3，突变体pif4，相比野生型气孔更加打开。PIF类的转录因子可能处于PHYB的下游，根据光环境变化调控气孔导度。而目前相关研究表明在高温环境下，PIF4作为负调控因子调控气孔发育。下胚轴伸长因子HY5，与PIF类起拮抗作用。

光会阻止HY5的降解，HY5的靶定目标是PIF4，HY5会使得PIF4进行降解，所以在缺光的条件下，会通过PIF类因子促进下胚轴伸长。广泛的遗传育种以及生化研究已证实HY5控制光调节转录变化，超过1/3的基因组会受到转录因子HY5的调控作用，但目前缺少HY5参与全植物蒸腾管理以响应光变化的作用研究。尽管缺乏与HY5相关的蒸腾数据，有研究表明HY5会影响气孔发育，发现HY5会靶定到STOMAGEN基因上，从而诱导表皮层中气孔发育，进而导致气孔密度以及气孔指数（气孔与表皮细胞的比率）的增加。

然而，有研究表明HY5影响气孔发育是有限制条件的，认为其跟植物接收到的日照时长相关，只有在长日照的环境条件下，HY5调控植物响应光信号进而控制气孔发育，在短日照生长条件下没有影响。这些研究表明在HY5调控作用下，气孔感知光信号的不确定性，也同样表明HY5在蒸腾作用中提供了额外的动力。

除了光以外，糖也会影响下胚轴伸长。己糖激酶1是一种葡萄糖磷酸化酶，除催化作用外，还会介导糖感应，并支持糖诱导的下胚轴生长。编码的己糖激酶1基因HXK1会在保卫细胞中进行特异性表达，导致下胚轴比野生型幼苗长三倍。除下胚轴生长以外，HXK1的表达大约减少20%的蒸腾作用。

2.材料与方法

2.1植物材料与生长条件

拟南芥Col-0生态型,pif4-101,hy5,

GCHXK,GCGFP,GCPIF4/pif4

GCHY5/hy5,GCHKX/GCHY5,

GCHXK/GCHY5/hy5,GCHXK/hy5,GCHY5-GFP,GCHXK/GCHY5-GFP

所有拟南芥光照条件，光强为150 μmol m-2 s-1，10个小时光照。温度在20-22?C，湿度50% - 60%。拟南芥栽培基质为30%的蛭石，30%的泥炭，20%的凝灰岩，20%的珍珠岩的混合基质。烟草栽培基质为70%的凝灰岩，30%的泥炭的混合基质。拟南芥种植时间为2020年1月至2月，烟草种植时间为2019年9月，栽培地为半控制自然光条件下的温室。

2.2转基因烟草植物

构建含有保卫细胞的特异性启动子

KST1（KSTppro::AtHY5）的HY5基因表达载体，使用农杆菌转化法侵染烟草叶盘。

2.3全植物蒸腾

该试验使用功能表型系统平台，测定全植物每日的蒸腾速率。将野生型或者转基因的拟南芥或者烟草，每棵烟草单独种植在3.9L的盆中，每4棵拟南芥种植在3.9L的盆中。每个盆放置在称重单元上密封，防止生长培养基表面蒸发，每10s会采集1次数据，将3min以内采集的数据做平均进行下一步分析。将植物的蒸腾速率标准化为重量或者总叶面积。在整个试验过程检测光合有效辐射PAR值，以及饱和水汽压亏缺VPD值。试验结束后对植物进行干重测量。

2.4气体交换分析

使用LI-600荧光气孔计（LI-COR,USA）测量蒸腾速率与气孔导度，使用LI-6800便携式光合仪（LI-COR,USA）进行叶片气体交换测量分析，测量过程控制环境变量，光强在200 μmol m-2 s-1，二氧化碳浓度在400 μmol mol-1。蓝光光合有效光量子通量密度设置在5%，流量设置为150 μmol/s，饱和水汽压亏缺在1-1.1kPa之间，叶片温度在22?C。

2.5叶面积以及整个莲座丛的测量

对于图1、图4中描述的叶面积测量，移除叶子，移除整个莲座结，使用LI-3100（LI-COR,USA）叶面积仪确定分析面积，使用ImageJ软件

2.6 Kleaf的测定

全叶蒸腾速率E除以叶片水势Δ leaf，计算每片叶子的Kleaf。Δleaf =?Ψleaf，光处理 – Ψleaf，暗处理。E测量完毕后将叶子转移到压力室（ARIMAD-3000, Israel）来确定?Ψleaf，光处理。然后将同一植物的另外一片叶子完全覆盖锡箔纸，转移到压力室去测量Ψleaf，暗下，测量在10:00-13:00（开灯后1-4个小时）进行。

2.7共聚焦显微成像

使用Leica SP8激光扫描显微镜（Leica，German）对GCHY5-GFP成熟植物进行图像采集，使用488nm激光获取GFP信号图像，Hyd检测器在500-525nm范围内检测发射。使用PMT检测器在650-750nm范围内检测叶绿体的自发荧光。

2.8气孔测量

对于气孔密度和指数测量，去除表皮并立即进行成像，每个生物学重复随机选择三个区域进行扫描和平均（n=10）。在每个区域中，气孔和表皮细胞，均在明场倒置显微镜下成像（1M7100 Zeiss,Germany）。显微镜上安装有HV-D30CCD（Hitachi,Japan）显微镜尺（Olympus, Japan）用于校准尺度。

2.9统计分析

使用JMP 16软件进行统计分析，使用Student t检验、Tukey的HSD检验或Dunnett方法比较平均值。当P<0.05时，平均值被认为存在显著差异。

3.结果

3.1保卫细胞中PIF4和HY5过表达改变蒸腾作用

植物的光反应由PIF4和HY5等转录因子介导，PIF4促进下胚轴伸长，HY5则阻碍下胚轴伸长，HY5和PIF4存在对光的特异性反应，而光对蒸腾作用影响较深，所以探究HY5和PIF4对植物蒸腾作用的影响。假设PIF4与HY5转录因子以拮抗作用的方式改变蒸腾作用。使用气体分析仪测定转基因拟南芥的AtPIF4（GCPIF4）或AtHY5（GCHY5）植物的蒸腾速率，在拟南芥WT植物的保卫细胞中，GCPIF4植物表现出较低的气孔导度和蒸腾速率（图1，A与B）。虽然低蒸腾量可能会导致生长抑制，但是没有在GCPIF4植物中观察到生物量的减少（图1，C与D）。

图1 拟南芥，WT为野生型，#4，#5，两个不同的转基因株系，GCPIF4为在保卫细胞中特异性表达的基因。图A为蒸腾速率的变化，图B为气孔导度的变化，图C为干重的变化，图D为叶面积变化的箱线图。方框内的线表示中值（n=8-10）。星号表示转基因株系相对于野生型的显著差异（Dunnett检验，P<0.05）。

与GCPIF4植物相反的是，与WT相比，GCHY5植物表现出更高的蒸腾速率和气孔导度（图2，A与B），植物出现了生长抑制（图2，C）。

图2 图ABC为拟南芥植物，图DEF为烟草植物。图A为野生型与转基因不同株系的蒸腾速率，图B为野生型与转基因不同株系的气孔导度，图C为野生型与转基因不同株系的干重。图ABC方框内线为中值（n=8-12）。图D为日动态变化下的饱和水汽压亏缺与光合有效辐射值，图E为蒸腾速率的日动态变化，图F为日中（10:00-12:00）蒸腾速率变化，图F方框内线中值为（n=17-18）。星号表示转基因株系相对于野生型的显著差异（Dunnett检验，P<0.05）。

在保卫细胞中瞬时表达HY5-GFP融合基因，也观察到类似现象（图3），在成熟叶子的保卫细胞中观察到GFP荧光信号（图3，A），且出现较高的气孔导度（图3，C），和生长抑制（图3，D与E）。这些结果进一步表明GCHY5会促进蒸腾。为了探究HY5转录因子的作用，以及其对蒸腾作用的影响，在烟草中转入GCHY5基因，其中GCHY5含有保卫细胞特异性启动子，在保卫细胞中表达。通过使蒸渗仪刻度系统，连续监测转入GCHY5基因植物的全株昼夜蒸腾行为，连续测量水分耗散，光强和饱和水汽压亏缺日动态变化（图2，D），以及蒸腾速率（图2，E）。在拟南芥日动态蒸腾速率监测中，发现在上午转入GCHY5基因的蒸腾速率高于野生型WT（图2，E与F）。结果进一步支持HY5基因在保卫细胞中特异性表达进而提高蒸腾速率。

图3 在成熟叶片叶肉保卫细胞中瞬时表达HY5，增强气孔导度，阻止生长。图AB，含有编码绿色荧光蛋白GFP的融合基因的转基因株系。HY5-GFP在表皮中分布，白色箭头表示目标基因在保卫细胞中的位置（染成绿色），橙色箭头表示目标基因在叶肉细胞的位置（染成洋红色），白色比例尺为50μm。图CDE为野生型与转基因株系的不同指标，图C为野生型与转基因株系的气孔导度，图D为野生型与转基因株系的干重，图E为野生型与转基因株系的莲座面积。

3.2 pif4拟南芥突变体中转入GCPIF4补充验证降低蒸腾速率且提高水分利用效率

pif4拟南芥突变体比野生型WT有着更高的气孔导度和蒸腾速率，但在pif4突变体中再转入GCPIF4，就会抑制气孔导度与蒸腾速率的高表达。测量转入GCPIF4的pif4突变体的光合速率，发现其光合速率与野生型pif4突变体中表达相差不大（图4，C），转基因植物与突变体相比，光合速率变化不大，蒸腾速率降低，由此而导致其水分利用效率有所提高（图4，D）。在转入GCPIF4的pif4突变体中，蒸腾作用降低不会使植株生物量受损（图4，E与F）。

结果表明光敏色素转录因子PIF4在植物蒸腾作用中起到核心作用，此外在保卫细胞中表达的GCPIF4，不会受到存在于其他组织细胞中的PIF4的影响。

图4 在pif4突变体中转入GCPIF4进行补充验证，转入之后发现植株水分利用效率有所增强。图A到D分别为不同样本的气孔导度，蒸腾速率，光合速率，以及水分利用效率的变化。WT为野生型拟南芥，pif4为突变体，GCPIF4/pif4 #5为在突变体中转入GCPIF4进行补充验证的转基因5号株系，GCPIF4/pif4 #15，为转基因15号株系。方框内线为中值（A到D，n=6-12。EF，n=8-12）。采用Tukey's HSD检验，P ?<0.05不同字母表示差异显著。

3.3 在突变体hy5的保卫细胞中过表达GCHY5会提高蒸腾速率

采用蒸渗系统测量全株植物的蒸腾速率，测量在hy5突变体保卫细胞中过表达ATHY5的蒸腾速率。GCHY5/hy5植物相比突变体hy5和野生型植物WT，一天中蒸腾速率显著增加（图5，A）。日中蒸腾速率（平均12:00-14:00），当蒸腾处于峰值时，转基因株系GCHY5/hy5 #7 ，转基因株系GCHY5/hy5 #12，分别比拟南芥突变体hy5高25%，9%。结果表明在保卫细胞中HY5转录因子对蒸腾作用起到正向调节。

GCHY5/hy5植物与hy5突变体光合能力相似（图5，C），但这些转基因株系蒸腾速率较高，所以水分利用效率IWUE相对较低。只在转基因株系GCHY5/hy5 #12中发现干重显著降低，阻碍了生物量的增长（图5，E）。与WT背景下过表达GCHY5相比，GCHY5在突变体hy5内对植物生长的影响是微弱的（图2，C）（图3，D与E）。

图5 在拟南芥hy5突变体中转入GCHY5促进蒸腾，样本为拟南芥野生型WT，突变体hy5，以及在hy5突变体保卫细胞中特异性表达hy5的转基因株系，转基因株系GCHY5/hy5 #12，转基因株系GCHY5/hy5 #7。图A为四类样本蒸腾速率日变化动态，图B为四类样本日中（12:00-14:00）蒸腾速率的平均值（n=6），图C为四类样本的光合速率，图D为四类样本的水分利用效率IWUE。图B与E箱线图中值为6，图C与D箱线图中值为6-8。星号表示相对于hy5而言有着显著差异（Dunnett检验，P<0.05）。

3.4 GCHY5可作用于GCHXK从而减少植物蒸腾作用降低的效果

保卫细胞中的HY5转录因子促进蒸腾作用，有研究表明，转录因子GCHY5可抵消由己糖激酶HXK引导的幼苗下胚轴伸长效应。在幼苗中GCHY5会终止下胚轴生长，HXK不仅会促进下胚轴生长，且在成熟植物中会导致20%的蒸腾速率降低。本研究探讨在植物中GCHY5能否逆转GCHXK导致的蒸腾降低作用。GCHY5/GCHXK/WT为野生型植株背景下共转入GCHY5/GCHXK。GCHY5/GCHXK/hy5在hy5突变体背景共转入GCHY5/GCHXK。

结果表明在野生型植物背景下共转入GCHY5/GCHXK的植物蒸腾速率高于仅转入GCHXK的样本。说明GCHY5在野生型植物的背景下表达可逆转GCHXK引发的低蒸腾量（图6，A与B）,但在hy5突变体背景下，GCHXK/GCHY5/hy5的蒸腾速率与GCHXK的植株一样蒸腾速率较低，也许仅在保卫细胞HY5转录因子调控，不足以逆转GCHXK诱导的低蒸腾作用，GCHY5的逆转作用的发生也许同样需要其他组织细胞中存在AtHY5。

在GCHY5/GCHXK/WT与GCHXK/GCHY5/hy5样本中，叶片水力传导率Kleaf与野生型植物的并无显著差异，而GCHXK样本中的Kleaf显著增加，与之前研究相似。另外之前研究转入GCHY5会提高蒸腾作用，而这与叶片的水力导度没有明显关系。

图6 GCHY5逆转GCHXK的低蒸腾作用的能力取决于内源AtHY5的表达，对叶片水力传导。图A在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT样本下的蒸腾速率，图B在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT样本下的日中（12:00-14:00）蒸腾速率，平均值（n=6），箱线图中值（n=6），图C为在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT样本下的叶片水力传导率Kleaf，箱线图中值（n=10-14）。星号表示与野生型相比有显著影响

4.讨论

使用保卫细胞特异性启动子，在保卫细胞中特异性表达，PIF4降低蒸腾速率，HY5则会提高蒸腾速率。除了特异性启动子，最近研究表明PIF在组成型启动子下表达也会影响蒸腾。在玉米以及胡萝卜中过表达ZmPIF3、ZmPIF1和DcPIF3导致蒸腾作用降低，但耐旱性有所提高。在pif3，pif4拟南芥双突变体中，气孔孔径大于野生型植株。

与PIF相比，HY5与气孔运动的关联研究很少。气孔对蒸腾的影响，主要关联气孔运动以及气孔发育。气孔密度（单位面积内保卫细胞的数量）影响蒸腾速率，成熟叶的气孔密度是由起初气孔形态分化的第一阶段定性的，随后会受到表皮细胞扩张的影响。

GCPIF4可作为提高植物水分利用效率的潜在工具，PIF4会限制蒸腾作用，但在蒸腾减少时，生长并未收到明显的影响。

GCHY5引发长距离信号影响蒸腾作用，当HY5缺失时（hy5突变体背景下，GCHXK/GCHY5/ hy5），GCHY5不能逆转GCHXK的低蒸腾作用（图 6 A-B）。GCHY5诱导的蒸腾反应取决于其他组织中是否存在AtHY5。最近研究表明GCHXK虽抑制HY5，但是转录分析中发现PIF1、PIF3、PIF4的表达增加。GCHXK造成的低蒸腾作用可能直接影响PIF4和HY5，但还存在一种解释GCHXK和GCHY5产生两个冲突的独立的信号，总和达到一定影响蒸腾速率。

保卫细胞中操纵基因表达会改变下胚轴长度，且与蒸腾水平呈负相关。后续相关研究可从下胚轴长度与蒸腾作用的关系进行探究。

详见原文

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945222004083#bib48