LC-MS直接表征工艺过程中的糖型分布和杂质变化，您Get了吗？

 由于双特异性抗体、融合蛋白和抗体偶联药物等新分子开发的复杂性、错配和聚集倾向等因素，LC-MS方法比单独使用传统滴度测量法更适于推动理想候选药物的选择。通过省略常用的Protein A纯化步骤为完整分子量分析提供了一种简化的工作流程，非常适合在上游开发和克隆选择实验室中与Ambr系统⼀起使用。此方法开创性地结合了BioAccord LC-MS系统的稳健性和易用性与Ambr多并行生物反应器系统的高通量自动化性能。 

图1. 细胞株开发过程中所需的分析支持（摘自Janssen公司Andy Mahan博士在2022 ASMS Waters User Meeting上的演讲）。

主要糖型和低分子量杂质表征可使用反相液相色谱-质谱联用法通过完整分子量流程进行分析。高分辨率质谱能够准确测量治 疗药物分子量、相对丰富的糖型组合以及其它翻译后修饰，即使这些蛋白形式的相对丰度低至1-5%，也能以更少的样品来鉴定，并且得到可信度良好的结果。LMW杂质表征已经采用了多种分析技术，包括SDS-PAGE、体积排阻色谱、亲水作用色谱(HILIC)-质谱联用技术以及反相液相色谱-质谱联用技术(RPLC-MS)。其中，RPLC-MS的分析时间更快、系统稳健性更高且信息量更大，特别受上游实验室青睐。过往，由于传统样品管道中存在传输限制，生物治 疗性药物CQA的分析通常仅对采集的⼀部分样品进行。分析所得的CQA数据随后由分析人员传递给上游科学家，数据传递通常在培养物运行完成数周后进行。这种传统的工作流程限制了采集样品总数，使许多CQA无法用作工艺监测指标或工艺控制驱动因素。

本研究利用在24位Ambr15系统上开展的单克隆抗体开发实验展示了一种用于分析主要糖型分布和低分子量杂质的简单而直接的方法。

图2. Ambr15系统（左）、BioAccord LC-MS系统（右）。

 实验结果展示01快速呈现细胞培养物的LC-MS结果趋势变化研究发现，上游工艺数据，包括活细胞密度(VCD)、活力和代谢物在对照条件下与预期⼀致，符合该细胞系和培养基组合的历史趋势。在反馈条件下，葡萄糖目标浓度开始保持在较高12 g/L水平，之后降低到标准5 g/L。恢复5 g/L水平比目标浓度变化滞后大约两天，可能是因为细胞生长减缓且日常补料中含有标准葡萄糖导致消耗量减少。CS1在对照条件下的VCD峰值最 高，其次是葡萄糖反馈条件和高葡萄糖浓度条件。这种条件性趋势在CS2中遵循相同模式，不过与CS1对应容器相比，所有CS2容器中的细胞生长都有所减缓。这结果符合预期，因为CS2在第3天降低了温度。

通过连续500次进样评估了BioAccord系统直接分析澄清的Ambr15生物工艺样品适用性和性能。在澄清的上清液中观察到三个色谱峰，分别对应目标抗体、游离的修饰轻链以及轻链共价二聚体（图3a）。有轻链特征的色谱峰包含至少十种蛋白形式（图3b），主要物质的分子量为23,526.89和23,712.94 Da, 分别对应于用额外的半胱氨酸残基和谷胱甘肽修饰轻链。轻链二聚体的去卷积谱图中未发现修饰（图3c），原因可能在于C-端半胱氨酸共价键。完整单克隆抗体的去卷积谱图与复杂N-糖具有⼀致的糖型分布（图3d）。 

图3. 细胞培养物经过离心和过滤后通过LC-MS分析观察到的主要物质UV色谱图(a)和去卷积质谱图，可以看到：轻链包含几种修饰形式(b)，其中C-端半胱氨酸的半胱胺酰化和谷胱甘肽化尤为显著，还展示了轻链⼆聚体(c)和完整单克隆抗体(d)的去卷积质谱图。

通过监测完整抗体的UV峰面积以及根据UV测量的抗体相对丰度评估了重复进样的色谱性能（图4a和4b），还在500次进样中跟踪监测了糖型的相对丰度（图4c和4d）。总体而言，四个指标在整个稳健性评估期间均表现出优异的重现性，没有明显的信号衰减或失真迹象。原始UV峰面积（图4a）和完整分⼦量测量值百分比的RSD分别为2.9%和0.19%。值得注意的是，通过相对比较目标单克隆抗体及其片段的UV峰面积得到所有完整分子量测量值百分比均在88% - 89%之间（图4b）。测得的保留时间也非常稳定，所有进样的保留时间均为2.3分钟。四种主要糖型的质量精度（图4c）也相当优异，介于-15 - 15 ppm之间。G0F/G0F、G1F/G0F和G1F/G1F糖型的相对丰度RSD分别为6.7%、5.1%和6.5%。

 图4. BioAccord LC-MS在以下方面的性能（a.完整单克隆抗体的UV峰面积；b.通过比较完整单克隆抗体及其低分子量LMW)片段UV峰面积得到的完整单克隆抗体相对丰度；c.完整单克隆抗体糖型的质量精度；d. 根据各糖型的去卷积MS信号强度计算出的糖型相对丰度）。

使用Ambr15在⼀系列温度和葡萄糖条件下进行工艺优化实验，于第2、4、6、8、10和11天测量完整糖型分布以及半胱胺酰化和谷胱甘肽化轻链的相对丰度。为每种生长条件的实验绘制G0F/G0F糖型相对丰度与培养时间的函数关系图（图5a）。在所有条件下，该糖型的相对丰度都随着分批补料实验的进行而不断变化，相对丰度持续下降，并在第6天达到最 小值。与对照组相比，较高葡萄糖浓度和较低温度导致相对丰度升高，可能是因为在这种条件下少量半乳糖基化物质的生成增加或半乳糖清除引起的。这种现象在第6天就能轻松看出来。有趣的是，较低温度和较高葡萄糖浓度导致这种效应更加显著，第11天的糖谱差异达到25%。葡萄糖补料和温度对糖型分布的影响表明，通过调节葡萄糖浓度、温度和时间可以让糖型丰度的变化在可测量范围内。在培养实验早期使用此类数据有助于战略性改变工艺和补料参数，获得理想糖型分布。

低分子量(LMW)杂质可引起患者的免疫反应，并且会降低产物总收率。研究发现，一般情况下，单克隆抗体的纯度在整个培养过程中逐渐降低，这现象与LMW物质（如未合并的轻链）增加相对应（图5b）。较低温度下的纯度低于对照温度下的纯度。有趣地是，高浓度葡萄糖条件下产生的纯度略高，这种转变早在第2天和第4天就已十分明显。这些结果表明，策略性调节葡萄糖补料可能会有效提高所研究工艺的产物相对纯度。 

图5. a. 八种分批补料条件培养过程中的G0F/G0F糖型相对丰度；b. 对照温度、较低温度、对照葡萄糖浓度和高葡萄糖浓度反应器条件下的低分子量物质(LMW)纯度。

03

灵敏监测修饰相对丰度的趋势变化

使用来自RDa飞行时间(TOF)质量分析器的MS信号监测游离轻链的半胱胺酰化和谷胱甘肽化形式的相对丰度。半胱胺酰化是指游离半胱氨酸与蛋白质上未配对的半胱氨酸形成⼆硫键，通常位于单克隆抗体轻链的C-端。这种翻译后修饰可能与培养物中可用的半胱氨酸量有关。谷胱甘肽化是指蛋白质在氧化或亚硝化应激条件下发生的⼀种调节细胞损伤的机制。因此，谷胱甘肽化轻链的相对丰度可用作评估细胞培养物氧化应激的⼀个指标。从糖型分布中可以看出，修饰轻链的相对丰度随时间推移而变化，半胱胺酰化形式在第6天达到最 小值（图6b），与之对应的是谷胱甘肽化形式达到最 大值（图6a）。有趣的是，在较低温度下培养的四个培养站中半胱胺酰化轻链的丰度最 高，而在对照温度条件下，培养物并没有表现出向更丰度谷胱甘肽化轻链转变的强烈趋势，这种差异早在第4天就已经很明显了。因此，谷胱甘肽化轻链的丰度降低似乎与温度下降和细胞生长减缓有关。要确定具体的因果关系，还需要进⼀步调查，但不可否认，验证这些关系的能力是个强大的工具。

图6. 8个培养站中谷胱甘肽化(a)和半胱胺酰化轻链(b)随时间推移的相对丰度。

今天我们分享了一种采用LC-MS直接表征工艺过程中的糖型分布和杂质新方法，重 点如下：

对于 Ambr15系统培养的澄清但未纯化的细胞培养物，使用BioAccord LC-MS系统/BioResolve色谱柱直接分析低分子量杂质和单克隆抗体糖型分布的⽅法，简单而直接。可每隔⼀天从24/48个并行生物反应器中取样并分析产品质量属性；

丰富的数据集表明，在整个培养过程中监测产品质量属性可以揭示理想工艺参数和补料策略，有助于提高产物纯度并定制糖型分布；

使用Ambr15和Ambr 250高通量多并行生物反应器评估克隆候选药物的生产率和培养基策略是上游工艺开发的常用方法。将BioAccord LC-MS与Ambr系统一起引入上游实验室可大大提高通量，并将总数据周转时间从数周缩短至24小时以内。

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讲座日期：

2022年6月22日（周三），16:30 - 19:30（北京时间）

参考文献

1. Lindsay Morrison, Charles Prochaska, Alireza Aghayee, Clint Kukla, Ying Qing Yu, Direct LC - MS Characterization of Glycoform Distribution and Low Molecular Weight Impurities in mAb Process From Ambr®15 Bioreactors. Waters and Sartorius Application Note 720007580EN.2022;

2. Yun Alelyunas, Charles Prochaska, Clint Kukla, Mark Wrona, Ying Qing Yu, In-Process Media Monitoring Using the BioAccord™ LC - MS for the Automated High throughout Multi-Parallel Ambr®15 Microbioreactor System. Waters and Sartorius Application Note 720007581EN.2022;

3. 沃特世Upstream Bioprocess Development网页。