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Capto DeVirS填料在疫苗工艺开发中的应用
发布:Cytiva(思拓凡)浏览次数:72亲和层析因其结合特异性的特点在层析工艺开发中具有非常重要的作用,如单克隆抗体工艺中的Protein A亲和填料、血液制品抗凝血酶工艺中的Heparin填料、质粒工艺中的嗜硫亲和填料、腺相关病毒工艺中的特异性亲和填料等,疫苗工艺中也存在着一款应用广泛的亲和填料——Capto DeVirS。
Capto DeVirS是一款基于高流速琼脂糖的粒径为75 μm的亲和填料,具有优异的压力流速性能,图1为水在BPG100的层析柱20 cm柱高的情况下的压力流速曲线,在3 bar的压力下可以运行超过600 cm/h的线性流速。Capto DeVirS的配基为硫酸葡聚糖,其结构如图2所示。硫酸葡聚糖配基可以和多数病毒表面蛋白发生特异性结合,如流感病毒、呼吸道合胞病毒、黄热病毒、慢病毒等,其结合机理并未有公开报道的严谨说明,目前推测结合发生在硫酸葡聚糖的羟基(氢键)和磺酸基(离子键)。
图1. 水在BPG100,20 cm柱高Capto DeVirS层析柱中运行的压力流速曲线
图2. Capto DeVirS硫酸葡聚糖配基
CHO表达的重组呼吸道合胞 (RSV) 疫苗培养结束后,采用两级的深层过滤以去除细胞碎片等杂质,然后经过0.2 μm过滤器过滤以降低微生物负荷。澄清后的料液经过吐温80孵育进行病毒灭活,病毒灭活后的料液由亲和填料Capto DeVirs进行捕获,RSV Pre F蛋白可以与Capto DeVirs结合,大量的宿主蛋白流穿,经过高盐洗脱,蛋白得到提纯并起到浓缩的作用。表1为Capto DeVirs在重组呼吸道合胞 (RSV) 疫苗应用的基本参数。
表1. Capto DeVirs纯化重组呼吸道合胞 (RSV) 疫苗的基本参数
层析填料
Capto DeVirS
柱高
10~20 cm
保留时间
5~8 min
平衡Buffer
50 mM PB, pH 7.0-7.4
洗脱Buffer
20 mM PB, 235 mM NaCl, pH 7.0-7.4
载量
30~50 g/L
图3. Capto DeVirS在重组RSV疫苗工艺中的应用
Capro DeVirS可以用于细胞流感疫苗的纯化。MDCK细胞在微载体Cytodex 3上进行培养至细胞密度达到2500000 cells/ml,转染流感病毒,转染后72收获。下游工艺采用Capto DeVirS和Capto core 700的组合,Capto DeVirS层析步骤HA回收率达到94%,宿主DNA去除达到2.8 log,宿主蛋白去除达到5~7倍。Capto core 700进一步去除宿主蛋白3~5倍。表2为Capto DeVirS在流感病毒疫苗中的应用参数及效果,图4为Capto DeVirS纯化细胞流感病毒的层析图谱。另外,Capto DeVirS也可以用于昆虫细胞表达的多价重组流感疫苗(HA抗原)的纯化。
表2. Capto DeVirS在流感病毒疫苗中的应用参数及效果
层析填料
Capto DeVirS
柱高
10~20 cm
保留时间
8~10 min
平衡Buffer
20 mM PB, 150 mM NaCl, pH 7.2
洗脱Buffer
20 mM PB, 500 mM NaCl, pH 7.2
HA recovery
94%
DNA reduction
2.8 log
HCP reduction
5~7倍
图4. Capto DeVirS纯化流感疫苗层析图谱
Monath等开发的基于VERO细胞的灭活黄热病疫苗的下游工艺中采用了Capto DeVirS填料。此工艺采用Cytodex 1微载体培养工艺,在XDR50一次性生物反应器中进行培养,经过澄清及核酸酶处理,Capto DeVirS和Capto core 700两步层析,达到满意的质量要求。表3为经过两步层析后相关残留的量。
表3. 黄热病病毒经Capto DeVirS和Capto core 700两步层析后残留数据
Residual HCP(μg/ml)
Vero cell ELISA
<0.2
Residual DNA(μg/ml)
PCR assay
NA
Virs recovery
Vero cell ELISA
25%~35%
Appavu K. Sundaram等开发了基于Capto DeVirS和Capto core 700两步层析的4价登革热疫苗工艺,图5为其整体工艺流程图,细胞培养收获液经50 kDa膜包浓缩换液,Capto DeVirS层析、灭活、Capto core 700层析、加入稳定剂及除菌过滤得到原液。表4为Capto DeVirS层析的基本参数。
图5. 登革热疫苗下游工艺流程
图6. Capto DeVirS和Capto core 700层析图谱
表4. Capto DeVirs纯化登革热疫苗的基本参数
层析填料
Capto DeVirS
柱高
10~20 cm
保留时间
8~10 min
平衡Buffer
5 mM PB, pH 7.4
洗脱Buffer
5 mM PB, 1 M NaCl, pH 7.4
Fina Biosolutions公司开发了大肠杆菌表达的白喉毒素突变体CRM197工艺,CRM197在SHUFFLE细胞表达,菌体破碎后经深层过滤澄清、Q Sepharose XL阴离子流穿、10 kDa膜包超滤浓缩换液,超滤后料液进行Capto DeVirS层析,CRM197可以与Capto DeVirS填料结合,高盐洗脱样品纯度可达95%以上。表5为Capto DeVirS纯化白喉毒素突变体CRM197的基本参数。
表5. Capto DeVirs纯化登革热疫苗的基本参数
层析填料
Capto DeVirS
柱高
10~20 cm
保留时间
4~8 min
平衡Buffer
25 mM PB, pH 8.0
洗脱Buffer
25 mM PB, 1 M NaCl, pH 8.0
Sample
电导小于10 mS/cm, 含一定浓度urea
Capto DeVirS是一款针对多种病毒表面蛋白特异性结合的填料,载量及纯化效率高,压力流速性能优异,填料耐碱,方便使用后清洁,表6为此款填料使用的建议。
表6. Capto DeVirS填料使用建议
建议的平衡
Buffer
20 mM sodium phosphate, pH 6.8
建议的洗脱
Buffer
20 mM sodium phosphate, 1.5 M NaCl, pH 7.4
在位清洁CIP
1 M NaOH,接触时间30 min,反向清洗
消毒
0.5~1 M NaOH,接触时间1 h
高压灭菌
121℃,15 min,25次
保存
2~8℃,20%乙醇
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2024-04-11相关仪器 -
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