分选细胞，一个都不能少

当我们在分选细胞时，总是在与时间赛跑。预约的时间段，分选样本要提前准备好，又不能提前太久。仪器参数调节，方案设置都会占用预约时长。分选过程中，希望目的细胞尽快返回到培养箱继续培养。而那些等待被分选的细胞，每一个都是那么珍贵，希望全部都被分选到。

Arnold and Lannigan (2010)

在确定喷嘴直径后，为了使液滴稳定，振动频率会落在一定范围。而细胞在液滴中的分布会服从泊松分布，以下图为例，如果我们选择P=0.25，也就是每4个液滴里含有一个细胞。那么对于任何一个选定液滴，将会有78%的概率是空液滴，19%的概率是含有一个细胞。

所以，当分选速度高于一定值时，分选的efficiency会下降。也就是意味着在纯度分选模式我们所期待的一些目标细胞，会因为不满足分选条件而被丢弃。

于是，你会看到有些同学，在分选细胞时，因为目标细胞所占比例低，又怕分选efficiency低，浪费目标细胞，于是使用2000EPS左右的速度进行分选实验。

这种佛系操作，无疑会造成更长的分选等待时间，在漫长的分选后，最开始被分选下来的细胞活性也会下降。面对这种情况，大家可以使用混合分选模式。既能满足纯度要求，又不会让目标细胞白白浪费进入废液桶，并且将分选速度维持在高速状态，缩短分选时间，提高细胞活性。

在上面的示意图中，绿色的点代表目标细胞，红色的点代表其它细胞。

01 在纯度分选模式

●如果目标细胞在分选液滴中，而非目的细胞不在分选保护带时，这个液滴会被分选至接收管。

●如果当非目标细胞进入分选保护带，含有目标细胞的液滴会因为不符合纯度模式的要求而被舍弃，进入废液桶。

02 在混合分选模式

●我们在开启纯度分选模式的同时，如果遇到非目的细胞进入分选保护带，这些目标细胞会被分选之其它接收管，而不会被丢弃到废液桶。

●实验结束，可能含有非目标细胞的接样管，根据实际纯度可以决定是，直接使用还是二次分选。

案例分享

CytoFLEX SRT 高速分选高纯度细胞群

如前所述，相对于液滴形成速率，分选速度较高则分选效率较低（即排除率较高）。在这部分中，我们利用混合分选模式从一路液流中分选出高纯度细胞群，并将该液流和其他分选液流的排除事件输送到另一路液流。通过这种方式，排除事件可用于其他实验，而不是当废液处理。

图1显示未分选样品染色情况。

图1. 记忆T细胞分选前样品分析。冻干人淋巴细胞CYTO-COMP细胞试剂盒（产品编号6607023）溶解后按照使用说明使用DURAClone IM T细胞亚群（产品编号B53328）染色，并在CytoFLEX SRT细胞分选仪上采集数据。使用CytExpert SRT软件绘制区域。显示所有区域的细胞群统计结果，以便与分选后细胞群进行比较。

下面显示从图7所示样品分选CD4记忆T亚群的情况。三个目标细胞群均使用纯度模式分选，排除事件输送到分选液流R2，见图2。

图2. 纯度模式分选事件和被捕获排除事件的管分选统计数据。管分选窗口显示四路分选液流的设置，目标细胞从图7所示样品中圈选。L2、L1和R1位置设为纯度模式，R2用于捕获其他三路液流的排除事件。

四路液流中只要有一路未使用，就可以将任何一路或所有其他液流的排除液滴输送到该路液流，从而实现目标细胞群无损失分选。

图3显示排除液流的分选后分析。示图涵盖所有选定事件以及导致排除的污染物。

图3. 纯度模式分选事件和被捕获排除事件的管分选统计数据。管分选窗口显示四路分选液流的设置，目标细胞从图7所示样品中圈选。L2、L1和R1位置设为纯度模式，R2用于捕获其他三路液流的排除事件。

成功小窍门

●分选需要掌握速度、得率和纯度之间的平衡。一般情况下，上述三项指标只可以优先考虑其中两项，余下一项必受影响。

●如果出现导致大多数排除事件的污染细胞群，排除液流对故障排查很有帮助。重新分析排除液流还可以发现设门策略中的缺陷。

●排除法还可以保留感兴趣的细胞群，即便细胞群已受污染，保留的样品重新分选，获得更高的纯度。

●请记住，可以将数路排除液流合并成一路液流，或将其分离为单独的排除液流。

●富集模式分选的事件不存在排除事件。