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多种细胞计数和活率检测影响因素的评估

发布：贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司

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Vi-CELL BLU细胞计数和活率分析仪，不仅具备了Vi-CELL XR细胞计数仪的主要功能，譬如可以实现不间断上样检测，自动吹打混悬样品，自动加台盼蓝吹打染色等。同时，Vi-CELL BLU融入了客户提出的一些设计方面的改进建议，增加了96孔板高通量上样检测模式。

图1、Vi-CELL BLU细胞计数和活率分析仪

（96孔板和24位转盘）

细胞计数和活率分析看似简单，但实际测试结果有时会受到来自样品稳定性和仪器测试条件等多方面的影响。使用96孔板上样检测，可以在单次实验中使用不同的实验条件，帮助我们评估这些不同的条件对测试结果的影响。为了证实96孔板上样模式的这些功能，我们使用了几种细胞在不同的实验条件进行检测分析。

分析检测的细胞

培养的CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞），EL4细胞（小鼠T淋巴细胞系），SF9昆虫细胞（来自甜菜夜蛾卵巢组织）和HELA细胞（宫颈癌细胞）。

不同重悬液的影响评估

细胞接种或做其他实验之前的细胞换洗和浓缩过程中，离心和重悬是常用的方法。一般认为CHO细胞是比较好生长的，但有时它们也会有特别的生长要求，需要专门的培养基才能很好地生长。譬如，以下实验中的CHO细胞通过1000g离心5min后（相对温和的离心），在培养基或PBS缓冲液中重悬，然后评估不同细胞制备条件对细胞计数和活率分析结果的影响。

结果显示：在推荐的培养基中离心和重悬对这种CHO细胞没有明显的影响。但是在PBS缓冲液中重悬对这种CHO细胞活率的影响很大，和平均细胞直径一样都明显变小。同时，细胞浓度也有一些降低，可能是在重悬过程中对细胞造成了损伤。在PBS中的第二次离心和重悬对该细胞活率和直径继续产生负面的影响。

图2、 CHO细胞样品制备方法的影响

不同混合次数的影响评估

EL4细胞通常被认为是易碎的，而且即使在理想条件下生长也比较缓慢，并且活率一般<70%。我们制备了EL4细胞后分装到96孔板中。细胞类型使用哺乳动物细胞参数，只是混合次数有所差异。目的是评估增加混合后细胞受到混悬和离心破坏的影响有多大。

根据EL4细胞的测试结果（如上表所示）可以看到：总细胞计数，总细胞浓度和直径都没有怎么变化，而活细胞数随混合次数增加逐渐下降，因而细胞活率也相应下降。这表明对于这类细胞，减少吹打混悬和台盼蓝混合次数可能会更适合，过多的混匀吹打需要避免。

图3、混合次数对EL4细胞的影响

不同检测时间的影响评估

3.1 SF昆虫细胞

即使在理想条件下SF9细胞生长要达到高密度也不容易，通常活率都在60%以下。因此96孔板测试导致仪器检测总时间延长，可能会对排在后面的待测细胞产生负面影响。我们使用了标准昆虫细胞的参数在96孔板上对SF9昆虫细胞进行了评估。

结果显示在测试的3小时过程中，细胞活率没有检测到有大的影响，细胞直径也没有太大变化，但如果细胞死亡或膨胀，这两个参数是会改变的。虽然活率较低，但在离开细胞培养环境后比较长时间内并没有不利影响，所以这些细胞足够强壮。

图4、SF9细胞离开培养环境后，

较长一段时间中表现出的活率和平均直径

3.2 HELA细胞

让HELA细胞生长成高度融合状态产生胁迫效应，然后对细胞收集并重悬分散。再将细胞分装到96孔板中，通过标准哺乳动物细胞类型测试得到分析结果。96孔板按每列的顺序依次检测，从而保证每行之间细胞检测间隔时间是一致的。

注意到96孔板后面的样品得到稍微更高的浓度。同时更多的研究发现，随着时间的增加细胞的平均直径会逐渐变大。

图5、HELA细胞随时间增加平均直径增大的百分比图

通过观察得到的细胞图像发现，细胞数量的增加看上去是膨胀或气泡，同时还伴有许多非细胞颗粒。虽然通过细胞分析参数设置，后者（非细胞颗粒）通常不会对细胞计数产生影响，但它们可能被计数为小细胞。膨胀效应导致在3小时的检测时间中（96孔板）平均细胞直径增加大概10%，而且可能导致低于最小直径阈值的小细胞也被统计到计数结果中。