质粒的生产工艺——从实验室到GMP

       质粒是一类小的、双链环装DNA分子，携带染色体以外的遗传信息，由于具有自我复制功能，被广泛应用于生物制药领域。在细胞基因治 疗产品中，质粒是构建病毒载体及目标基因转入的关键传递载体。在治 疗或预防性药物中，质粒又可以作为终产品注入人体内，进行目标蛋白的表达。早在2017年，全 球范围内以裸质粒型基因治 疗药物的临床方案（包含DNA疫苗）就达到了428个，随着临床成功的级别不断提升，以及产品在进入后期临床研究阶段上的进步，行业对质粒DNA的需求量不断上升。相应的，对于质粒DNA的生产和质控也提出了更高的要求。

       质粒DNA的生产包括一系列的工艺步骤，为了确保质粒制备的适宜条件，需要前期开展大量的条件摸索，包括大肠杆菌的培养条件优化。实验室规模的大肠杆菌培养有很多局限性，特别是缺少培养过程监控，导致过程参数无法被实时控制。目前，实验室规模的大肠杆菌培养更多采用摇瓶培养这种终点检测法，这对深入理解并优化工艺参数是十分不利的。后续工业化生产不仅要求高产量，而且对质粒的质量（如超螺旋百分比）、生产成本以及工艺可放大性提出了更高的要求。而这一切的基础就是对培养过程的深入理解与优化。丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特生命科学的BioLector Pro微流控高通量微型生物反应器，可以在微孔板上进行完整的生物工艺控制，它采用一次性48位微孔板，具有在线测量生物量、荧光、pH和溶氧值(DO) 等数据的功能，同时还能通过微阀控制器和微流控通道控制 pH 和补料速率，很好地解决传统摇瓶及生物反应罐通量低、费时费力费原料或发酵过程为暗箱的难题，并可成功放大到1L和20L搅拌式生物反应器上。

BioLector Pro 

微流控高通量微型生物反应器

BioLector Pro – 大肠杆菌补料

发酵WR培养基，37℃，800 rpm，pH值=6.4，单向pH控制 (NaOH)，补料速率=5L/h 葡萄糖(500 g/L)，5h后开始补料梅花板 (FlowerPlate)

       在实验室阶段的菌液的收集可采用离心机来完成。在离心过程中，对于样品的保护和提高回收效率是非常重要的，有些样品在离心收集后，由于与离心管壁贴合不紧密，在转子减速过程中很容易再次悬浮起来，造成沉淀的回收率降低。贝克曼库尔特生命科学的 Avanti J-15R制冷型台式高效离心机，内置 Ultra Harmonic Technology (UHT) 超平稳离心技术，能够智能加减速，减少样品扰动重悬，实现样品保护并提高回收得率。另外Avanti J-15R的转头可选配生物安全密封盖及Aerosolve透明密封杯，防止气溶胶污染。

       在质粒DNA的GMP生产中，考虑到效率和放大的问题，菌液的收集一般采用中空纤维或微滤膜包，然后采用一次性混合器Wandmixer进行菌体碱裂解，接着采用大肠杆菌重组RNase来去除RNA。考虑到成本问题，一般是采用CaCl2絮凝及NH4HCO3沉淀的方式，通过深层过滤以及除 菌过滤得到澄清料液，从而进行捕获层析，然后结合产品的实际情况选择不同的工艺进行精制纯化，此时会得到比较纯的质粒，接下来进行超滤浓缩，制剂混合，最 后进行除 菌罐装。丹纳赫生命科学旗下Pall拥有从菌液收获到除 菌过滤的质粒纯化及制剂混合和除 菌罐装的方案。

       另外，在菌体裂解后，还可使用贝克曼库尔特超速离心机搭配NVT 100/90/65 近垂直转头（k因子小，可大幅度缩短离心时间），采用CsCl密度梯度离心方法可实现mg级到g级无内毒素超螺旋构象质粒的纯化，大大提高后续转染效率。

       目前，多种先进技术已用于获得大量纯化的质粒产品，相应地安全性和符合监管的要求也日臻完善，其中高质量、高纯度的超螺旋质粒是确保基因制剂安全性和有效性的前提条件，也是质粒检测的关键质量属性。EMEA，FDA以及中国都对用于基因制剂的质粒DNA中超螺旋百分比含量有一定的要求。

       使用丹纳赫生命科学旗下SCIEX 的PA 800 Plus毛细管电泳制药分析系统，结合激光诱导荧光检测器（LIF）和dsDNA 1000 试剂盒，可以对质粒的三种拓扑结构进行高效分离，并能准确计算超螺旋百分比，用于质粒的纯度检测。

       生物制药的快速发展，促进了行业对质粒的需求增长，丹纳赫生命科学具有一系列从实验室研究到GMP生产的质粒工艺及质控方案，来满足日益增长的质粒DNA生产的需要。