干货 | 从质粒构建到病毒滴定，解锁病毒包装全流程

病毒载体包装的实验流程主要包括质粒制备、细胞培养、质粒转染、病毒收获与纯化四个核心阶段。其中，质粒转染环节是消耗大量质粒的关键步骤，其用量与包装规模直接相关。

1.1质粒类型包含：

弃去培养液，PBS溶液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和细胞碎片。使用1mL胰蛋白酶来消化细胞，使其从培养皿上脱落。消化完成后，用1mL完全培养基中终止消化，并调整细胞密度至每10毫升含有500万个细胞；将这些细胞重新接种到新的10厘米培养皿中培养，确保在转染前细胞密度达到80%左右这个密度是转染的最佳条件，可以提高转染效率和病毒产量。

注意:在复苏细胞后，需要传代至少2次才能进行病毒包装实验。这是因为复苏后的细胞需要一定的时间来恢复其正常生理状态。同时，传达后的18-24小时内，需要确保细胞密度达到80%左右，以便进行后续的转染操作。

转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，10mL/10cm皿，注意293T细胞的贴壁性不是很好，换液的时候尽量沿着侧壁加液体。

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液）， 将收集的上清用 0.45 μm 滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。

弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于 4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。（注：具体重悬体积根据实验需求而定）。

在 96 孔板中铺合适数量的 293T 细胞，第二天将慢病毒原液进行梯度稀释后分别感染 293T 细胞，感染 24 h 后换成无病毒的培养液，感染 72 h 后在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10 ~ 30% 之间）的孔进行细胞计数。

滴度计算公式为：滴度（TU/ml）=细胞数 ×荧光百分比×10³ / 病毒原液体积

核心结论：原代细胞、干细胞、免疫细胞和神经细胞（如SH-SY5Y）是内毒素敏感细胞系的代表，必须使用增强型去内毒素质粒大提，推荐翌圣超纯无内毒素质粒大量提取（Cat#19038ES）；而HEK293、HeLa等耐受细胞系可适当放宽要求，仍建议使用高质量质粒。