干货 | 人肾脏类器官构建知多少？一文读懂！

• 启动分化（Day 0）：吸弃培养基，用500 μl PBS轻柔清洗一次。随后加入 500 μl 含 3-10 μM CHIR99021（53003ES） 的基础分化培养基（Advanced RPMI 1640 + L-GlutaMAX），根据细胞系类型，可选择性添加5-25 ng/ml Noggin（92528ES），以优化诱导效率。

• 首次换液（Day 2）：吸弃旧培养基，加入 500 μl 含相同浓度CHIR99021的新鲜基础分化培养基。

• Activin A处理（Day 4）：培养4天后，于显微镜下观察，应出现“松散密集的细胞团簇”。吸弃旧培养基，加入 750 μl 含 10 ng/ml Activin A 的基础培养基，连续培养 3天。

• FGF9处理（Day 7）：吸弃旧培养基，加入 500 μl 含 10 ng/ml FGF9 的基础培养基，连续培养 2天。至Day 9，可通过免疫荧光染色验证，通常可获得高比例的SIX2阳性肾单位祖细胞。

  
  

图2.hPSC分化过程中的形态变化

• 消化与收集（Day 9）：吸弃孔板内的培养基，加入300 μl PBS清洗后吸弃。加入 300 μl Accutase，于37°C消化10-15分钟。用移液器轻柔吹打使细胞完全离散，并用等体积基础分化培养基中和。

• 3D接种：离心收集细胞，弃上清。使用含 3 μM CHIR99021 和 10 ng/ml FGF9 的基础分化培养基重悬细胞，将密度调整至 500,000 cells/ml。向96孔超低附着板的每个孔中加入 200 μl 细胞悬液（即 100,000个细胞/孔）。

• 离心聚集：将培养板以 300 × g 离心 15秒，使细胞在孔底中心聚集。

• 预聚合体形成（Day 9-11）：将培养板放入培养箱中，连续培养 2天。

• 肾小泡形成（Day 11-13）：使用200 μl移液器轻柔吸弃100 μl旧培养基，注意避免吸到细胞团。加入 200 μl 含 10 ng/ml FGF9（不含CHIR99021）的新鲜基础分化培养基。继续培养 2-3天，直至在显微镜下观察到清晰的、具有折光性的球状肾小泡结构。

• 成熟与维持（Day 14+）：轻柔吸弃 85-100 μl 旧培养基，加入 100 μl 不含任何生长因子的基础分化培养基。此后，每2-4天 按此比例更换一次新鲜培养基。肾单位结构通常在1-2周内逐渐发育成熟。

图3.NPC和肾单位的免疫染色

参考文献：

Morizane R, Bonventre JV. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2017;12(1):195-207. doi:10.1038/nprot.2016.170.

翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。