2025 药典重磅更新！一文读懂糖基化分析全流程与安捷伦黑科技

蛋白糖基化是一种主要的翻译后修饰 (PTM)，糖链的分布和组成可影响疗 效和免疫原性。糖基化会受到许多不同因素的影响，并会发生一定程度的异质性。因此，糖基化被认为是必须控制以确保良好蛋白质质量的 CQA。

2025 年版《中国药典》III 部新增了糖蛋白的糖基化分析等 5 个指导原则以及修订了包括N糖谱测定法等近 20 个通则。这些新增指导原则与通则不断提升标准的精确性与针对性，并补充了更精 准的测定方法与分析技术，有力地确保了产品的质量和稳定性。

我们对糖基化分析指导原则（图 1）和 N-糖谱测定法（表 1）更新总结如下：

表 1. 糖基化分析流程及方法

图 1. N-糖谱分析通用方法

通过表 1，可以发现液相色谱/质谱 (LC/MS) 系统已广泛用于分析完整蛋白和亚基水平，肽段水平，以及表征  PTM。

安捷伦为糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、单糖的全面分析（图 2）。包括：

■ 前处理平台

■ Agilent 1290 Infinity III 液相色谱系统和 Agilent PLRP-S/AdvanceBio 专用色谱柱

■ Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系统和/或荧光检测器 (FLD)

■ 合规的数据处理软件

图 2. 安捷伦糖型/糖链表征工作流程

安捷伦 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

在蛋白糖基化表征中的应用案例分享

根据蛋白的复杂性、与药物安全有效的相关性以及生产监控策略的总体设计等，安捷伦对不同水平的主要工作流程进行了相关研究。

Ⅰ.完整蛋白/亚基水平

在完整蛋白质水平表征 mAb 糖型，是快速评价和监控 mAb 糖基化最为常用的方法。以 NIST mAb 为例（图 3），主要糖型均获得了低至 ppm 级的误差和出色的谱图清晰度，同时可获得主要糖型修饰的相对比例。其他较小的糖基化异质性（例如 GlcNAc 残基缺失），也可轻松鉴定。

图 3. 完整 NISTmAb 的质谱解卷积结果及主要糖型的相对定量（进样量 0.5µg）

rhEPO（重组人促红细胞生成素）是一种活性糖蛋白。由于其糖基化位点多，糖型结构复杂，一直被视为糖基化表征的难题。从图 4 可以看出，完整的 rhEPO 分子量分布在 30KDa 左右，而其氨基酸序列的分子量仅不到 20KDa，因此糖含量高达 50% 以上。

图 4. 重组人促红细胞生成素的质谱解卷积结果

Ⅱ.亚基水平

使用 DTT 或 TECP，对蛋白进行还原，以便完全还原链间二硫键。使用 IdeS 酶对蛋白酶切后再还原，用 scFc 看糖型的类型和比例，亚基水平可以获得比完整蛋白水平更丰富的糖型信息，也可以用做亚基的 MAM。

图 5. Ideas 酶切 NIST mAb 还原后 scFc 解卷积结果

Ⅲ.糖肽水平

对于糖基化的位点研究，通常在肽段水平在进行。与 N-糖基化不同，O-糖基化往往会在同一条肽段上出现多个修饰位点，此种情况下使用优先断裂糖苷键 CID（碰撞诱导碎裂）的碎片，很难判断修饰位点。ECD（电子捕获碎裂）碎裂技术是在 2015 年由 e-MSion 公司研发。该公司于 2023 年成为安捷伦的一分子。ECD 碎裂时，多电荷的肽段在碎裂时完整保留了糖苷键，碎裂效率高，碎片信息丰富，可以用于糖基化位点的修饰分析。使用 6545XT QTOF 的 ECD 技术，对融合蛋白依那西普（Enbrel）的 O-糖基化位点进行了确认，共鉴定到 12 个 O-糖基化位点，为 O-糖基化表征提供了技术依据（图 6）。

图 6. 依那西普肽段 SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPK 第 4, 7, 11, 12, 15, 16 和 25 位的 S/T 7 个 Core1 糖基化修饰 ECD 碎片及位点修饰判断的关键碎片 c2,c4,c8,c10,c11,c12,c15,c16,c17,c32 和 z7

Ⅳ.游离寡糖水平（以N-糖谱为例）

在游离寡糖水平可以获得全面丰富的蛋白寡糖类型结构和含量信息。以游离N-糖分析为例，通过 Gly-X InstantPC 试剂盒，可以在 45min 内实现蛋白的酶切、标记到净化。经过色谱分离后，进行 LC-FLD/MS 的定量/定性分析（图 7）。配合 PCDL 数据库，可以覆盖常见单抗和融合蛋白的 N-糖种类，使用方便。

图 7.  InstantPC 标记的西妥昔单抗 N-糖的 LC/FLD 色谱图 (A)；根据 MS 数据生成的提取化合物色谱图表明荧光谱图中有无法检测到的聚糖峰 (B)

在游离寡糖水平的鉴别和定量工作中，含高唾液酸的糖蛋白药物的寡糖结构更加复杂，因此 2025 版《中国药典》开发了针对的通用方法（图 1）。安捷伦基于此开发了一种含高唾液酸糖蛋白药物的游离寡糖分析方法，使用阴离子交换色谱柱，为这类分子的 N-糖定量提供可重现的高通量解决方案。以康柏西普为例（图 8），该方案稳定可靠，每个峰所带的唾液酸数量均通过标准品定性，并获得良好分离。

图 8.  InstantPC 标记的康柏西普样品连续六次进样的叠加色谱图

唾液酸会影响蛋白药物的半衰期和免疫原性，因此有必要对糖蛋白中的唾液酸进行测定。色谱法可以实现不同种类唾液酸的分离，专属性强，且具有更高的灵敏度，因此，2025 版《中国药典》对唾液酸的色谱法进行了补充。安捷伦唾液酸分析与定量解决方案线性范围宽，定量限和检测限结果良好，可用于糖蛋白中唾液酸的测定（图 9）。

图 9. DMB 标记的 (A) Neu5Ac 质谱图；(B) Neu5Gc 质谱图；（C）西妥昔单抗的唾液酸 UHPLC 荧光谱图；（D）Neu5Ac 和 Neu5Gc 校准曲线和 LOD 及 LOQ

安捷伦生物药糖基化分析中的优势

总结如下：

a、快速、完整的游离寡糖和单糖样品前处理方案:

无需额外配备耗材，可快速完成样品前处理。相比传统的 2-AB 标记，专 利的标记试剂 InstantPC 荧光强度和质谱响应高 10 倍以上。

b、色谱分离：

1290 Infinity III Bio 超高效液相色谱仪系统采用生物兼容性流路，减少了待分析物与管路表面的非特异性相互作用。同时，Infinity Lab Assist 技术可以使工作效率提升 > 20%。针对不同类型的糖蛋白糖基化分析特点，专用的色谱柱确保快速、稳定和可重现的色谱分离结果。

c、高灵敏度 QTOF：

AJS 离子源帮助更好的聚焦离子，提高离子化效率，从而提高质谱检测的灵敏度。双通道 ADC 检测器保证了质谱测量的质量数和质谱响应的准确度。

d、BioConfirm的合规性软件平台：

专用 Fragile Swarm Tune 模式，只需勾选糖谱 PCDL 库和标记物类型，即可进行糖谱的匹配。

参考文献：

曹琰，赵雄，王晓娟等.2025 年版《中国药典》三部增修订概况[J].中国药品标准,2025,26(1): 28-33. doi: 10.19778/j.chp.2025.01.005

标签：安捷伦液相色谱系统