高效禽流感病毒小鼠感染模型的构建流程

高效禽流感病毒小鼠感染模型的构建流程

（一）背景

近日，quan'qiu病毒网络 (GVN) 是一个由lin'xian的人类和动物病毒学家组成的国际联盟，其遍布 40 多个国家的 80 多个zhuo'yue中心和附属机构已在《柳叶刀区域卫生 - 美洲》上发表了关于北美正在发生的 H5N1 禽流感疫情的详细分析和紧急行动呼吁。ding'jian科学家发表了一项行动呼吁，敦促各国政府应对北美日益严重的 H5N1 禽流感疫情，该疫情已感染动物和人类，并造成了重大农业损失。

（二）禽流感病毒（H5N1/H7N9）小鼠感染模型构建标准操作流程

主要仪器设备：北京元森凯德生物公司研制生产的动物全身/口鼻动态气溶胶暴露系统） + YSKD动物气管肺递送定向暴露模块  

生物安全等级：BSL实验室（符合WHO《实验室生物安全手册》第四版） 

一、实验前准备

1. 动物选择与预处理

6-8周龄SPF级BALB/c或C57BL/6小鼠（优先选择IFNAR1敲除品系以增强病毒易感性），独立通风笼具（IVC）中预适应7天，温度22±1℃，湿度50-60%，12小时光照循环，通过实验动物fu'li伦理委员会审批（参考AAALAC国际认证标准） 

2. 病毒株与攻毒液配制

病毒株H5N1或H7N9，TCID₅₀测定为1×10⁶~1×10⁸/mL，病毒原液以PBS（含0.3% BSA、100 U/mL青霉素/链霉素）稀释至目标浓度，分装后-80℃保存，使用前经三次冻融循环确保病毒颗粒分散 

二、 病毒接种及感染模型构建步骤

2.1病毒稀释：将H5N1禽流感病毒株用病毒培养基稀释成不同浓度，低剂量感染组为1×10^4 PFU/mL，高剂量感染组为1×10^6 PFU/mL。

2.2 动物全身动态吸入/口鼻暴露染毒(北京元森凯德生物技术公司研制生产)

粒径控制：1-3 μm（模拟呼吸道飞沫核心粒径） 

暴露时间：全身暴露模式：30分钟（总病毒载量1×10⁴~1×10⁶ PFU/只），口鼻暴露模式：15分钟（靶向剂量1×10³~1×10⁵ PFU/只）

2.3动物气管肺递送精准定向暴露

小鼠麻醉：将小鼠放入麻醉诱导箱，使用3%异氟醚诱导麻醉，待小鼠倒立无挣扎后，转入维持浓度为1.5% - 2%的麻醉状态。

气管内定量雾化接种：

将麻醉后的小鼠固定在BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD生物安全型小动物固定操作台上，头部向上，颈部稍后仰。使用北京元森凯德生物技术有限公司研制生产的微量气管内液体雾化器【可精准定量】吸取适量的病毒稀释液（低剂量组50μL/只，高剂量组100μL/只），经BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD小动物可视化插管喉镜（内置微型CMOS摄像头，支持实时图像传输至外接显示屏），缓慢插入到小鼠的气管处，使病毒液雾化喷雾流入气管。对照组滴加等体积的病毒培养基。

2.4 感染后处理

小鼠转移至生物安全隔离笼具，恢复自主呼吸，实时监测生命体征（呼吸频率、活动度），记录感染后0小时基线数据。 

三、感染进程监测

3.1. 临床观察与样本采集

感染后第1、3、5、7天，监测指标/临床症状：体重下降率（>20%为人道终点）、竖毛、呼吸困难评分（0-4级） 

样本采集： 

    - 鼻咽拭子（病毒脱落量检测） 

    - 肺泡灌洗液（BALF，qRT-PCR检测病毒载量） 

    - 肺组织病理切片（HE染色评估间质性肺炎程度） 

3.2. 病毒动力学分析

qRT-PCR引物设计：靶向HA基因保守区（如H5N1 HA-F:5'-CAGCAATGCAGRACAGAT-3'），病毒滴度测定：MDCK细胞培养法（TCID₅₀/mL） 

3.3. 免疫应答检测

血清抗体：感染后第14天采集血清，ELISA检测H5N1特异性IgG（OD450≥0.5为阳性），细胞免疫：流式细胞术分析肺组织CD8⁺ T细胞比例（CD44⁺CD62L⁻效应表型） 

四、模型验证标准

4.1 感染成功率：感染后72小时肺组织病毒载量≥1×10⁴ TCID₅₀/g 

4.2 病理特征：典型肺泡上皮细胞坏死+淋巴细胞浸润（病理评分≥3分） 

4.3一致性验证：同一批次实验组内个体差异≤15%（CV值） 

五．注意事项

5.1. 实验人员需全程佩戴正压防护服（PAPR）及双重手套 

5.2. 病毒灭活：所有接触材料需经121℃高压灭菌30分钟 

5.3. 动物伦理：体重下降超过25%或出现严重呼吸困难时立即实施安乐处死(北京元森凯德（YSKD）提供自动型实验动物安乐窒息系统) 

本方案结合北京元森凯德生物技术有限公司,简称元森凯德（YSKD）研制生产的高精度气溶胶全身/口鼻动态气溶胶暴露系统） +动物气管肺递送定向暴露模块与闭环生物安全设计，确保实验可重复性。可满足禽流感病毒跨宿主传播机制研究、疫苗效力评价等前沿科研需求。

附：北京元森凯德生物技术有限公司研制生产的动物雾化吸入给药仪器，主要包括大/小动物肺部气管直接递送装置（动物气道雾化针）、动物口鼻吸入、仅鼻腔给药、全身式暴露染毒、动物烟气/PM2.5染毒系统、粉尘气溶胶发生器、臭氧动物暴露装置、动物高低压氧舱，此外给客户多样化提供自动型实验动物安乐死系统（窒息系统、二氧化碳安乐处死箱），实验动物除臭暂存系统，巴马香猪皮，NGI Gentle Rocker智能洗盘装置，NGI新一代撞击器和ACI安德森撞击器的校验与检测。

附：北京元森凯德生物技术有限公司（BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD），简称元森凯德（YSKD），2013年成立于北京中关村科技园，是一家专业从事生命科学类实验仪器研制、生产与销售的科技创新型企业。服务毒理学、药理学、免疫学、生物安全、大气污染物、化学物质毒性鉴定、临床前药物开发与安全性评价、呼吸系统、环境与健康等领域。

部分用户案例：哈佛大学，麻省理工学院，新加坡国立大学，瑞士苏黎世联邦理工学院，中国科学院上海药物研究所，中国中医科学院中药研究所，丽珠医药集团股份有限公司，康龙化成（宁波）生物医药有限公司，中日医院呼吸病学研究中心/中日友好临床医学研究所，北京中医药大学，中国药科大学，沈阳药科大学，复旦大学，浙江大学，四川大学，中南大学湘雅医学院等
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