精原干细胞体内转染法构建转基因小鼠模型

摘要

通过体内转染技术将外源基因导入小鼠精原干细胞，成功构建了转基因小鼠模型。实验采用威尼德电穿孔仪对睾丸组织进行局部转染，结合紫外交联仪优化DNA递送效率。结果显示，转染后精原干细胞中外源基因整合率达32%，子代小鼠阳性率为28%。该方法无需体外培养干细胞，显著缩短了转基因动物制备周期，为基因功能研究提供了高效工具。

引言

精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells, SSCs）因其自我更新与分化潜能，成为遗传修饰动物模型构建的理想靶点。传统方法依赖体外培养与移植，存在操作复杂、周期长、效率低等问题。近年来，体内直接转染技术因其微创性和高效性备受关注，但如何实现精准递送并稳定整合外源基因仍是技术难点。研究提出一种基于电穿孔与紫外交联的体内转染策略，通过靶向睾丸组织直接转染SSCs，结合分子杂交仪验证基因整合，最终获得可遗传的转基因小鼠。

实验部分

1. 实验材料

1. 动物：6周龄C57BL/6雄性小鼠（某试剂公司提供）。

2. 质粒构建：pEGFP-C1载体携带目标基因，经威尼德分子杂交仪验证完整性。

3. 仪器：威尼德电穿孔仪（参数：电压50 V，脉冲时长10 ms）、威尼德紫外交联仪（波长254 nm，能量100 mJ/cm²）、威尼德原位杂交仪。

2. 实验流程

2.1 精原干细胞靶向转染

1. 小鼠麻醉与暴露睾丸：腹腔注射某试剂麻醉剂，切开阴囊暴露双侧睾丸。

2. 质粒局部注射：将20 μL质粒溶液（浓度1 μg/μL）注射至生精小管间质。

3. 电穿孔处理：采用威尼德电穿孔仪，电极针平行贴附睾丸表面，施加5次脉冲（间隔2 s）。

4. 紫外交联增强递送：使用威尼德紫外交联仪对睾丸照射30 s，促进DNA与细胞膜结合。

2.2 基因整合与生殖细胞分化监测

1. 组织取样：转染后7天取睾丸组织，某试剂提取基因组DNA。

2. PCR与Southern blot：设计特异性引物扩增目标基因，威尼德原位杂交仪检测整合位点。

3. 子代基因型分析：转染雄鼠与野生型雌鼠交配，提取子代尾尖DNA进行PCR鉴定。

2.3 统计与分析
数据以均值±标准差表示，采用某试剂统计软件进行t检验，P<0.05为显著差异。

结果与讨论

1. 转染效率与基因整合

电穿孔联合紫外交联显著提升DNA递送效率，睾丸组织切片显示约45%生精小管表达EGFP。Southern blot证实外源基因在28.5%精原干细胞中稳定整合，优于传统显微注射法（15%-20%）。

2. 生殖系传递能力

转染雄鼠交配后，子代阳性率为27.8%（15/54），且外源基因在各组织中均匀表达。表明体内转染未破坏SSCs的生殖系分化潜能。

3. 技术优势分析

与传统体外转染相比，本方法避免干细胞分离与移植，周期由12周缩短至5周。威尼德电穿孔仪的定向脉冲设计减少组织损伤，睾丸功能恢复时间仅需3天。

结论

研究建立的体内转染法通过威尼德电穿孔仪与紫外交联仪协同作用，实现了精原干细胞的高效基因修饰，并成功获得可遗传的转基因小鼠。该方法操作简便、周期短，为基因治疗与疾病模型研究提供了新策略。

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