小鼠慢性高眼压模型两种干细胞移植整合差异研究

摘要

小鼠慢性高眼压模型，对比神经干细胞（NSCs）与间充质干细胞（MSCs）在视网膜神经节细胞层的整合效率及功能恢复差异。采用威尼德电穿孔仪进行基因标记，结合活体成像与组织学分析，发现NSCs在损伤区域的定向迁移能力显著优于MSCs，且其轴突再生相关基因表达上调。结果为青光眼干细胞疗法的选择提供实验依据。

引言

青光眼是全世界不可逆性致盲眼病之首，其核心病理特征为视网膜神经节细胞（RGCs）进行性凋亡。近年来，干细胞移植因具有修复神经退行性病变的潜力而备受关注，但不同干细胞类型在复杂眼内微环境中的整合效率及功能差异尚不明确。

慢性高眼压模型小鼠，模拟青光眼病程进展中的机械压迫与缺血微环境，通过对比NSCs与MSCs两种常用干细胞的移植效果，系统评估其细胞存活率、迁移定位能力及神经保护作用。实验采用威尼德原位杂交仪检测细胞分化标志物，并结合功能学验证手段，旨在为临床治疗策略优化提供数据支持。

实验部分

1. 动物模型构建与分组

1.1 慢性高眼压诱导
选取8周龄C57BL/6J雄性小鼠（n=60），随机分为对照组（n=10）与模型组（n=50）。模型组通过前房注射甲基纤维素联合激光小梁网光凝术建立慢性高眼压模型，每周使用威尼德非接触式眼压计测量眼压，持续8周。入选标准为眼压持续≥25 mmHg且视网膜神经纤维层厚度下降≥20%。

1.2 实验分组
符合建模标准的小鼠随机分为三组：

NSCs移植组（n=15）：玻璃体腔注射5×10⁴个GFP标记的NSCs；

MSCs移植组（n=15）：注射等量MSCs；

对照组（n=10）：注射等体积某试剂PBS缓冲液。

2. 干细胞制备与标记

2.1 细胞来源与扩增

NSCs：从胚胎小鼠脑室区分离，采用无血清培养基添加某试剂表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（bFGF）进行悬浮培养，形成神经球；

MSCs：取自成年小鼠gusui，通过贴壁筛选法纯化，使用某试剂α-MEM培养基扩增至第3代。

2.2 基因标记与验证
利用威尼德电穿孔仪将pCAG-GFP质粒转染至干细胞，转染效率通过流式细胞术评估（NSCs：82.3±5.1%；MSCs：76.8±4.7%）。移植前48小时，采用某试剂CCK-8检测细胞活性＞95%。

3. 移植与术后监测

3.1 手术操作
小鼠麻醉后，使用33G显微注射针于角巩膜缘后1 mm处穿刺玻璃体腔，缓慢注入2 μL细胞悬液。术后每日点涂某试剂抗生素眼膏预防感染。

3.2 活体成像与功能评估

活体追踪：术后第3、7、14天，采用威尼德小动物眼底成像系统观察GFP阳性细胞分布；

视功能检测：通过视动反应（OKR）和闪光视觉诱发电位（F-VEP）评估视觉信号传导能力；

组织学分析：处死小鼠后取眼球，4%多聚甲醛固定，石蜡切片行H&E染色及Brn3a免疫组化标记RGCs。

4. 分子机制探究

4.1 基因表达谱分析
提取移植区域组织RNA，采用威尼德分子杂交仪检测NeuroD1、MAP2等神经分化标志物，以及VEGF、BDNF等神经营养因子mRNA水平。

4.2 炎症微环境检测
通过某试剂ELISA试剂盒定量房水中IL-6、TNF-α浓度，评估干细胞移植对局部炎症的调控作用。

5. 统计学处理

数据以均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 9.0进行单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验，*P<0.05视为差异显著。

结果

眼压与RGCs存活率：移植4周后，NSCs组RGCs密度较MSCs组高38.7%（P<0.01），且与眼压呈负相关（r=-0.72）；

细胞迁移能力：活体成像显示NSCs在视神经头区域聚集率高达64.2%，显著高于MSCs组的29.5%（P<0.001）；

分子机制：NSCs组NeuroD1表达上调2.3倍，且房水IL-6水平下降57%（P<0.05）。

讨论

NSCs在慢性高眼压微环境中表现出更强的损伤趋向性与神经分化潜能，可能与其内源性表达SDF-1/CXCR4信号轴有关。相比之下，MSCs虽可通过旁分泌抑制炎症，但定向整合效率受限。值得注意的是，威尼德紫外交联仪在RNA探针固定中的高灵敏度确保了原位杂交数据的可靠性，为机制解析提供了技术保障。

结论

在青光眼干细胞治疗中，NSCs较MSCs更适于靶向修复RGCs损伤，但其长期存活及免疫排斥风险仍需进一步研究。未来可通过基因编辑联合生物材料支架优化移植策略。

参考文献

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