使用LAMBDA 365+紫外/可见光谱仪进行RNA定量和纯度评估

2023-09-21 18:50:13 347阅读次数

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引言

由于嘌呤和吡啶杂环芳香环的存在，核酸能够吸收260nm左右紫外线范围内的光。因此，易于利用朗伯-比尔定律进行RNA定量，该定律定义了样品浓度与光吸收量之间的正比关系。在本应用文献中，使用PerkinElmer LAMBDA 365+紫外/可见光谱仪建立校准曲线并简单测定RNA浓度。此外，可通过计算吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀来评估RNA溶液的纯度。

材料和方法

RNA, MS2（800μg/mL，溶于10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.0）购自Sigma-Aldrich，并用TE缓冲液稀释以制备40μg/mL RNA溶液。将2mL溶液移至1cm光程的比色皿中，并置于LAMBDA 365+紫外/可见光谱仪中作为Z高浓度的标准溶液。将仅含TE缓冲液的比色皿置于基准比色皿支架上，作为空白溶液。然后取出1mL标准溶液，加入1mL TE缓冲液，以在比色皿中直接稀释后续标准溶液。用于建立校准曲线的标准溶液的浓度范围为80–40000ng/mL。在UV WinLab软件中选择扫描定量（Scanning Quant）方法，使用表1中的扫描设置和校准设置参数建立校准曲线。为了验证该方法的准确性，制备了三份独立的40μg/mL RNA溶液以建立三条不同的校准曲线。

表1：用于建立RNA校准曲线的扫描设置和校准设置

扫描设置		校准设置
纵坐标模式	吸光度	组分	分析物（ng/mL）
波长范围	200–320 nm	曲线类型	线性
扫描速度	480 nm/min	纵坐标模式	高度（260nm）
循环	1	基线校正	单点（320nm）

校准曲线

TE缓冲液中RNA标准溶液的吸收光谱如图1所示。绘制260nm处获得的吸光度值减去320nm处的基线值与相应浓度的曲线图，以建立校准曲线（见图2）。

图1：用于建立校准曲线的RNA溶液（TE缓冲液中）的吸收光谱（浓度范围80-40000ng/mL）。

图2：260nm处获得的吸光度值减去320nm处的基线值与TE缓冲液中RNA标准溶液指定浓度的曲线图。插图为80-2500ng/mL浓度范围内的放大图。

校准详情可在UV WinLab软件生成的校准报告中查阅。对于使用三份不同初始标准溶液进行的所有三个独立实验，计算出的相关系数均高于0.9999，表明了所选方法的准确性。

图3：描述校准曲线的校准详情。

纯度评估

吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀通常用作核酸样品纯度的指标，以防止存在蛋白质或其他类型的污染物(即有机溶剂，非离子清洁剂，异硫氰酸胍、盐酸胍等盐类)。当吸光度比值为A₂₆₀/A₂₈₀≈2.1且A₂₆₀/A₂₃₀>1.8时，则认为RNA溶液纯度较高，可进一步用于下游应用。UVWinLab软件中的处理功能可以简单地计算吸光度比值，并直接显示在结果窗口中(图4)。还可以添加一个包含条件语句(if/else)的列，表明是否满足纯度条件。在本研究中，所有标准溶液均显示出良好的吸光度比值，表明了所分析样品的纯度。

图4：计算吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀以评估RNA标准溶液的纯度。

结论

使用PerkinElmer UV/Vis LAMBDA 365+光谱仪可以轻松实现RNA的定量。UV WinLab软件可以建立校准曲线，该曲线可用于测定未知浓度的RNA溶液。根据吸收光谱外推吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀，以评估RNA标准溶液的纯度。这些数值证明了所分析样品的良好质量。对于需要评估RNA纯度并确定样品是否可以进一步用于下游应用的生物分子实验室来说，此功能非常重要。