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基于EAD的Midde-Down分析全面表征生物制品的序列覆盖度和二硫键
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图1. 基于EAD的完全还原和二硫键连接的抗体亚基的Middle-Down分析。在2次进样中抗体亚基几乎完全实现序列覆盖(85%-93%)。EAD在单针进样中提供了完全还原的mAb亚基的高序列覆盖率(70%-85%)1-4。EAD对二硫键连接的亚基的特征性断裂导致从2个中心Cys残基之间的序列中间检测到独特的片段,如覆盖图中的橙色线所示5。这些片段显著增加了序列覆盖率,并提供了链内二硫键的高置信度图谱。
生物治疗表征中基于EAD的Middle-down分析的关键特征
超高序列覆盖率:完全还原和二硫键连接的亚基,为EAD结果提供了抗体亚基85%-93%的序列覆盖率
高置信度二硫键图谱:EAD导致二硫键连接亚基的独特断裂模式,用于快速准确鉴定二硫键,假阳性低
PTMs的精确定位:不稳定的PTMs保留在EAD片段中以进行精确定位
简化且易于实施:工作流程只需最少的方法优化,从数据采集到结果审查都得到了简化
结果分析
实现超高序列覆盖
总之,本文中描述的创新的基于EAD的Middle-Down策略通过利用完全还原和二硫键连接的亚基的互补EAD结果,在2次进样中实现了生物治疗药物的超高序列覆盖率(85%-93%)。这种强大的策略还能够基于二硫键连接的亚基的EAD结果在亚基水平上进行高置信度的二硫键鉴定。这种创新的Middle-Down策略通过克服Top-Down在片段效率和序列覆盖率方面的缺点,以及Top-Down在人为修饰、数据复杂性、假阳性和通量方面的局限性,为生物制药的全面表征提供了一种平衡的方法。该策略可以大大提高Mid-down MS对生物治疗药物的综合表征的效率和有效性。
总结
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2023-11-23相关仪器 -
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