EAD Talk | 文献分享：分子网络-电子活化解离（EAD）技术增强代谢物注释

中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究员的实验室，近期在analytical chemistry (IF 7.4)上发表文章，题目为“Enhancing Metabolome Annotation by Electron Impact Excitation of Ions from Organics-Molecular Networking”。创新性地提出，将有机物离子电子碰撞激发（EIEIO, electron impact excitation of ions from organics）碎裂技术和分子网络（MN）进行结合，大大加强了非靶代谢研究中代谢物的注释工作。

基于高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）的非靶向代谢组学研究已成为不同领域不可或缺的工具，如：疾病诊断、环境科学、食品安全等。质谱技术的创新进展大大提高了代谢组学的研究能力。然而，大规模、高精度的代谢物标注仍然是代谢组学研究的瓶颈，限制了对代谢组学数据的全面理解和利用。

分子网络（MN）对非靶向代谢组学数据的可视化和注释具有独特的优势。该课题引入了结构引导分子网络策略（SGMNS）。该方法利用从代谢物结构数据库中提取的化合物分子指纹相似性来构建分子网络。SGMNS整合了基于网络的代谢物注释和结构数据库的优势，使用几个初始种子代谢物，就能有效地注释成千上万的代谢物。该团队提出了一种新方法，将EIEIO和MN结合起来，以加强代谢物标注，并将建立的方法应用于前列腺癌研究。

EIEIO参考MS/MS数据库的缺乏，这点给使用LC-EIEIO-MS/MS注释非靶向代谢组学数据带来了巨大挑战。文中构建了EIEIO和CID模式下的代谢物片段库，其中包括ESI+和ESI?电离模式下的母离子m/z、Rt和MS/MS图谱信息。该片段库可用来注释代谢物，研究EIEIO的碎片特征以及谱图相似性与结构相似性的关联。

普遍认为，具有相似结构或亚结构的化合物很可能拥有相似的质谱MS/MS图谱。基于这一假设，人们提出了各种分子网络方法，如GNPS、SGMNS和KGMN等，用于非靶向代谢物标注。为了全面发挥分子网络注释代谢物的优势，加强Sim1（结构相似度）和Sim2（谱图相似度）之间的相关性至关重要。针对已建立的参考MS/MS数据库，使用CID和EIEIO模式获取的MS/MS图谱探讨了Sim1和Sim2之间的相关性；并对来源于ESI+和ESI?电离模式下的55,945和52,650对代谢物，进一步评估。结果表明：与ESI+ CID模式相比，ESI+ EIEIO模式中Sim1（结构相似度）和Sim2（谱图相似度）的相关性更强。此外，还评估了CID和EIEIO MS/MS图谱之间的相似性，结果表明：CID参考谱图并不适合注释EIEIO谱图。

谱图相似性网络（如GNPS)已被证明是一种从非靶代谢组学数据中捕捉结构类似物的有效方法。通过利用在ESI+ EIEIO和CID模式下获得的上述参考MS/MS图谱，建立了EIEIO和CID图谱相似性网络。谱图相似性评估结果显示，在对结构相似的代谢物进行聚类方面，EIEIO谱图相似性网络要优于CID（Figure 2）。

为对非靶向代谢组学数据进行深度注释，我们开发了一种结构引导的分子网络策略（SGMNS)。为了评估SGMNS对EIEIO非靶向代谢组学数据的有效性，作者选取构建了一个结构相似性网络（17651个节点和1128.23万条边)，Sim1（结构相关性）阈值为0.4，包括上万个从数据库中筛选出的代谢物。

该研究利用血浆样品（NIST SRM 1950)评估了结构相似性网络对EIEIO非靶代谢组学数据的注释性能，并与CID模式下的注释性能进行了比较。研究人员基于十种已知代谢物，利用结构相似性网络分别从LC-CID-HRMS/MS和LC-EIEIO-HRMS/MS数据中成功注释了1049和2337个代谢物特征（图3b)。此外，共有858个代谢物特征同时被两种解离模式注释，其中94.87%（814/858)的代谢物特征有相同的候选代谢物。结果显示，CID和EIEIO模式的注释结果可以相互补充和验证。

研究收集了来自24名健康对照组（HC)和27名前列腺癌（PCa）患者的代谢组学数据，以EIEIO/CID非靶向代谢组学分析为例进行分析。在CID和EIEIO模式下，分别成功获得了7073和6876个独特代谢物特征的MS/MS图谱。生成的主成分分析（PCA)得分图显示HC组和PCa组之间存在明显的差异（图4a)。通过非参数检验（nonparametric test）发现，HC组和PCa组之间共有812个代谢物特征存在明显差异（P＜0.05)（图4c)，其中87个代谢物是通过EIEIO或CID-非靶向代谢组学数据的结构相似性网络注释。对这87个差异显著的代谢物进行通路分析，结果显示多个代谢通路（鞘脂代谢、甘油磷脂代谢和亚油酸代谢)受到了不同程度的扰动（图4d)，这与之前的结果基本一致。

Figure 4.  (a) PCA score plot for QC, HC, and PCa groups. (b) The annotation results of QC samples in CID and EIEIO modes. (c) Volcano plot of the metabolite features from HC and PCa samples. (d) Pathway analysis of the 87 significantly differential metabolites. (e) Relative intensities of SM(41:1) and Plasmenylcholine in HC and PCa groups. (f) ROC curve of biomarkers for the diagnosis of PCa.

该研究利用EIEIO和MN的协同优势，为大规模代谢组学注释提出了一种新方法。结果表明，EIEIO图谱中丰富的片段离子能使图谱和结构相似性之间的相关性更强。这提高了MN对非靶向代谢组学数据的注释性能。结构相似性网络作为一种独立于谱图库的大规模注释方法，有效地解决了由于EIEIO谱图数据库缺乏而导致的EIEIO非靶向代谢组学注释的难题。这种方法只需要约10个已知代谢物就可注释数千个代谢物，这为大规模代谢组学注释提供了另一种解决方案。

ZenoTOF 7600由在2022年推出，不但包含传统的CID碎裂模式，还包含EAD碎裂模式。EAD碎裂模式和CID碎裂模式因其碎裂原理不同，其两者碎片表现出强互补性，为结构的准确鉴定提供了进一步完善的解决方案。

7600的EAD碎裂模式，因最大的应用特点就是：EAD的电子动能（KE，Electron Kenetic Energy），EAD参数）可调，保证了EAD技术可以在一台仪器上实现ECD（Electron Capture Dissociation）、Hot ECD（Hot Electron Capture Dissociation）和EIEIO三种裂解，从而使其能真正做到大分子和小分子应用的全兼容。EAD因其碎裂模式的独特性被广泛应用到肽段同分异构体、蛋白翻译后修饰、二硫键位点鉴定和小分子结构鉴定等定性、定量领域，为科学的进步发挥了独特作用。