Bigfoot高光系列之——高通量孔板分选功能

单细胞组学是近年来生命科学领域的热门研究话题之一，从基因组，到转录组，再到蛋白组学，代谢组学，表观组学以及空间组学，主要的研究热点集中在肿瘤、免疫、传染病及细胞进程等应用领域。

顾名思义，单细胞研究是指以单个细胞为单位来解析基因测序、蛋白表达、细胞功能的技术，此技术的基础和难点在于如何从复杂样本中进行单个细胞的制备。而强大的流式细胞分选仪无疑是实现单细胞分选的利器，相比于其他分选方法，参数多、速度快、准确以及通量大是流式分选的技术优势。

Bigfoot是全球第一台全光谱、超高速、高性能的流式细胞分选仪，具有强大的光谱解析和分选能力，其在硬件和软件设计上的创新性可确保单细胞分选的准确度、回收率和高速度。下面我们用一组实验来验证Bigfoot在高通量单细胞孔板分选方面的性能先进性。

为确保最佳分选条件，通过自动化软件设置流程并校准Bigfoot仪器条件，包括液流系统准备、液滴和偏转设置、光学对准和液滴电荷延迟计算。为了确保分选液流的准确定位，分别用校准板对 96孔和384孔PCR板、96孔和384孔细胞培养板、1536孔微孔板按照标准流程进行分选液滴校准。

为了全面验证仪器的分选性能，通过已发表的评价方法[1]配置分选策略，不同孔板中各孔分别设置不同的分选细胞数量。将96孔PCR板的分选策略配置为：A行分选4个目的细胞，B行分选3个目的细胞，C行分选2个目的细胞，D行分选1个目的细胞，E行不分选目的细胞，F、D和H行分选1个目的细胞。用96孔细胞培养板重复该分选实验，并用EVOS M7000成像系统验证分选后板孔中的细胞数量。

将384孔PCR板的分选策略配置为：A、C、E、G、I、K、M和O行分选1个目的细胞；B、D、F、H、J、L、N、P行不分选目的细胞。用384孔细胞培养板重复该分选实验，并用EVOS M7000成像系统验证分选后板孔中的细胞数量。

用高级分选模式将1个目的细胞分选到每个1536孔微孔板的板孔中，用1536孔玻璃底微孔板重复该分选实验，并用EVOS M7000成像系统验证分选后板孔中的细胞数量。

如前文所述，通过Bigfoot全光谱流式细胞分选仪获取前面制备得到的含有HRP的CHO细胞样本。调整488 nm前向散射光（FSC-A）和488 nm侧向散射光（SSC-A）参数PMT电压，使细胞群位于点图的左下角，根据FSC和SSC信号利用矩形门圈出目的细胞群；并在FSC-A x FSC-H图上设门，排除黏连体。在Hoechst 33342/SSC-A点图中圈出活细胞（图1）。所有分选的条件都用单细胞分选模式，速度为140个事件/秒。

图1. CHO细胞散点图设门策略。(A) 散射光参数FSC-A/SSC-A密度图，圈出目的细胞群；(B) FSC-A/FSC-H密度图，圈出单个细胞群；(C) Hoechst 33342/SSC-A密度图，圈出活细胞群。

图4. 1536孔板垂直分选模式的测试画面及孔板校准。

如果含有一个或几个经HRP染色CHO细胞的液滴分选到板孔中的TMB底物溶液中，就可以肉眼观察到孔板中HRP和TMB的显色反应（呈蓝色）。而且，颜色深浅随着分选液滴数量的增加而逐渐加深。图5显示了分选和孵育后的96孔PCR板示例。A行包含四个分选的HRP液滴，当与TMB底物反应时显示出鲜明的深蓝色。在下面的B行（3个液滴）、C行（2个液滴）和D行（1个液滴）中，显色反应逐渐变得越来越浅。E行在分选逻辑中被配置为分选零个细胞，因此孵育30分钟后仍为无色。F、G和H行在分选逻辑中被配置为分选一个目的细胞，显示出与D行类似的浅蓝色。

从在软件中执行分选开始，直至孔板返回原位以供用户检索，将此过程记录为完成一个96孔板所用的时间。表1和表2分别显示了用4路分选和垂直分选两种模式，针对所有五个96孔板记录的分选时间。四路分选时每个孔板的平均分选时间均少于8秒（见表1），垂直分选时每个孔板的平均分选时间均少于20秒（见表2）。如果不包括在仪器上安装孔板、启动分选和从仪器上移除孔板所需的时间，依次对所有五个96孔板进行分选，孔板间亦未进行重新校准，所有孔板四路分选的总分选时间为38.24秒，垂直分选的总分选时间为99.37秒。

表2. 利用单个液滴垂直分选模式完成整块96孔板分选所用的时间。

类似于96孔板，384孔也是用四路分选和垂直分选两种模式分别对5块PCR板隔行进行单个液滴分选，结果如图6所示。表3和表4显示的是分选5块384孔板所用的时间，四路分选每块板的分选时间少于18秒，垂直分选的时间均少于62秒。

表4. 利用单个液滴垂直分选模式完成整块384孔板分选所用的时间。

图7. 对悬浮在HRP溶液中的细胞进行单个液滴分选后的1536孔板，及用EVOS M7000成像系统拍摄的单孔CHO细胞图像。细胞分选完成后避光孵育15分钟，板孔中的TMB底物变成蓝色；利用EVOS DAPI (357/447nm) 光立方观察Hoechst 33342染色结果。

表6. 按照“BIGFOOT”文本模式，利用单个液滴垂直分选模式完成整块1536孔板分选所用的时间。

单细胞分选实验对仪器的性能有极高的要求，分选液滴必须以高准确度和高精确度沉积到低至2 μL的接收液中。影响分选效率的主要因素在于仪器的设计。液流的稳定性、固定板机械臂的稳健性以及孔板运动的速度都会影响分选结果的质量。

Bigfoot全光谱流式细胞分选仪的硬件经过精心设计，可在0.5秒内行经微孔板的整个表面，在孔间过渡时的滞留时间极小。通过定制设计的线性致动器系统、小螺距导螺杆、高扭矩电机和智能空间传感系统，在进行微孔板分选时可提供定位准确度和高分选速度。

此外，通过优化偏转路径和液滴电荷，偏转系统的设计可实现最稳定的液滴偏转。偏转距离和电荷板配置的设计允许在精确分选所需的整个空间内实现高度精确的偏转，同时保持较低的液滴电荷电压。液滴倾向于在电荷吸引作用下结合，因此液滴上的电荷量增加会带来隐患。正因如此，我们在设计中尽量减少电荷并最大化偏转距离，以便实现高度稳定而准确的液滴分选。

综上所述，Bigfoot全光谱流式细胞分选仪具有非常准确、稳健且高效的孔板分选功能。使用HRP方法，通过TMB底物与HRP的显色反应确认液滴分选的结果，单个液滴能够以小体积四路或垂直分选至96孔PCR板、384孔PCR板和1536孔板，定位准确度达到100%。此外，Bigfoot还能以前所未有的速度完成分选实验，其中96孔板的平均分选时间少于8秒，而384孔板的平均分选时间少于11秒，1536孔板的平均分选时间少于200秒。超快的分选速度依赖于Bigfoot独特的多路孔板分选功能，这在其他任何仪器上都无法实现。Bigfoot在高通量孔板分选中的独特优势，相信会成为当今和未来研究实验室的得力助手。