Dr.赛流式小课堂 | 流式同型对照 (Isotype Control)

在前两期我们一起了解过流式所有对照类型和荧光减一对照，点击下方链接，回顾上节课知识点！

新学期开学后，同学们仍然还是在流式对照上有些问题，让我们一起去问问Dr.赛吧。

Dr.赛，我发现eBioscience流式抗体在官网上会推荐同型对照抗体，同型对照抗体是啥意思啊？

同型对照抗体是指与目的抗体种属来源和亚型相同，带有相同荧光标记，但不能与靶标产生特异性结合的抗体。

那……为什么要设置同型对照呢？

目的是排除抗体的非特异性结合对实验产生干扰。让我们今天一起了解下同型对照吧！

我们来看看使用上表中的目的抗体和同型对照抗体检测Mouse Foxp3的数据（图1）：宿主/亚型同样为Rat / IgG2a, kappa且荧光为PE的抗体标记样品作为同型对照可以帮助我们划出阴性细胞群。在了解同型对照的含义及作用之后，相信大家已经知道选择同型对照的原则了：1）种属来源相同，2）亚型相同，3）荧光标记相同，4）不能跟特异性靶标结合。PS：我们的每支eBioscience流式抗体官网页面有相应同型对照推荐，很方便喔！

对于一些连续表达、低表达或激活性靶标（如CD45RO、CD25、CD80等），通常没有明显阴阳性分群，这时可以考虑设置同型对照，帮助划分阳性细胞群。我们可以看看图2a这个案例，使用CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APC, eBioscience?（货号17-0257-42）检测Human CD25，没有明显的分群界限，可以使用同型对照抗体Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), APC, eBioscience?（货号17-4732-81）标记样品之后辅助划门。

对于高表达靶标（如CD45、CD3、CD4等），在电压设置合适的情况下通常分群明显，一般不需要设置同型对照。我们可以看看图2b这个案例，CD45（洋红色峰）信号强且分群明显，即使不设置同型对照（蓝色峰）也能轻松划门。

需要注意的是，虽然同型对照能够帮助我们划门，但它并不能直接作为划门的依据，来看看下面这个案例吧。实验组有较为明显的分群，但如果直接以同型对照散点图分布来划门，就会“错失”很多阳性细胞；这时以实验组分群结果来划门，可以看到同型对照组和空白对照组P2区域细胞占比均为0.9%，最后将实验组阳性率减去0.9%即可。

哲学家曾说，世界上没有完全相同的两片树叶。那么Dr.赛说，世界上也没有完全相同的两只小鼠。既然目的抗体和同型对照抗体来自不同宿主，那么也就不存在完美的“除抗原识别位点外全都相同”的说法。这也是文中Dr.赛在讲解同型对照时用词（可能、几乎、一定程度上……）非常克制的原因。

那么同型对照到底有没有设置的必要呢？从实验的角度来说，需要根据自己的应用去决定是否使用同型对照：在多色panel分析时同型对照需要跟FMO(荧光减一)对照联合使用；实验过程中的某些步骤（如固定破膜，多克隆抗体使用……）可能导致较多非特异性结合时，也建议设置同型对照；当我们去探索一个新的靶标，不清楚其表达水平，同型对照能够作为我们划门的重要参考。Maurice R.G. O’Gorman在Isotype Controls—Time to Let Go? 一文中对同型对照的设置表达了肯定：Saying goodbye to isotype controls is premature. The use of isotype specific controls should be left up to the discretion of the individual responsible for the laboratory. 虽然这篇文献比较久远，但其中观点依然很有价值，感兴趣的话可以去搜搜原文。

问

同型对照的用量？

答

用量跟目的抗体一致；比如目的抗体加0.25 μg，同型对照抗体也加0.25 μg。

问

如若网页上没有推荐同型对照的抗体，如何查找其同型对照？

答

在浏览器中检索该网址，或扫描下方二维码，根据筛选器Filter进行筛选。

https://www.thermofisher.cn/antibody/

control/query/isotype%20control

*以上数据均出自赛默飞流式细胞术精品培训班，所用流式细胞仪为Attune? NxT流式细胞仪。

活动时间：2024.3.18-2024.3.24

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流式实验设计对照的经历和故事

我们将于活动结束后2周内

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流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。

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