行为学实验手册｜学习记忆系列之水迷宫实验方法

学习与记忆

学习是高等生物接受外界环境变化获得新行为和经验的过程，常见的学习形式有非联合型学习和联合型学习两种。人或动物受到一次或多次单一刺激后形成的、并不需要将两个以上刺激或刺激与反应之间形成明确联系的过程，如习惯化（习以为常），称为非联合型学习；人或动物受到一系列事物刺激、且在时间上很靠近地重复发生，ZH在脑内逐渐形成联系，如操作性条件反射，称为联合型学习。

记忆是对学习获得的经验或行为的保持，包括获得、巩固、再现及再巩固四个环节，常见的有程序性记忆与陈述性记忆。程序性记忆即无意识情况下建立的无法用语言描述的记忆，如使用筷子；陈述性记忆指可以用语言描述的关于过去经历或事件的记忆，包括事实、事件、情景以及他们间的相互关系等，如回忆并说出事情经过。

学习与记忆二者是互相联系的神经活动过程，学习过程中必然包含记忆，记忆也总是需要以学习为先决条件。以实验动物为对象，采集并分析动物的行为信息是学习与记忆的常规研究手段之一。例如：利用动物自发活动特性进行研究、通过奖惩等操纵进行研究等。今天我们主要介绍利用动物自发活动进行研究的最常用手段之一：Morris水迷宫中的平台探查实验研究方法（常规的水迷宫实验包括Morris水迷宫、通道式水迷宫等，由于Morris水迷宫最常用，本文主要介绍Morris水迷宫）。后续我们还会介绍：T/Y迷宫、放射性迷宫（八臂迷宫）、物体识别（新物体识别、位置物体识别）、操作性条件反射（斯金纳箱）、穿梭箱、跳台、避暗箱、巴恩斯迷宫等。

实验方法步骤

1.原理

1981年，Morris基于动物厌恶水环境的特性建立了水迷宫方法，实验动物被迫游泳，学习寻找隐藏在水中的平台。通过记录实验动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

2.文献

Partial loss of psychiatric risk gene Mir137 in mice causes repetitive behavior and impairs sociability and learning via increased Pde10a.

3.实验设备

Morris水迷宫、Smart 3.0软件、摄像系统等。

4.实验方法

常用实验分组方法

01、已知品系的记忆缺陷转基因动物模型

(1)对照组：按照实际实验需求选定（分类一：工具鼠的空载鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分类二：同笼阴性鼠、转基因品系背景鼠等）

(2)转基因对照组：不作任何处理的转基因动物

(3)转基因实验组：对转基因动物进行额外处理，如给药，注射病毒等

02、定向基因编辑待验证的转基因动物

(1)对照组：按照实际实验需求选定。（分类一：工具鼠的空载鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分类二：同笼阴性鼠、转基因品系背景鼠等）

(2)转基因组：不作任何处理的转基因动物

03、验证药物造模效果-学习记忆变强/变弱

(1)对照组：不作任何处理的动物

(2)实验组：使用造模药物使动物学习记忆能力变化的动物

04、验证受试药物对造模药物的恢复效果

(1)对照组：不作任何处理的动物

(2)药物造模组：使用造模药物使动物出现记忆力问题的动物

(3)实验组：对药物造模组动物使用受试药物恢复的动物

*所有实验动物均进行同样的实验流程，在实验开始就应对需要给药的动物进行给药

适应阶段

实验开始前3-7天（自己繁育小鼠 Handle 3天，外购动物 Handle 7天），每天抓取、轻抚动物，让其熟悉实验人员手，在实验过程中不会处于应激状态。

学习阶段

01、旗帜标记学习(1)实验设置

• 在迷宫臂交叉垂直的四个方向的水面上方分别放置一个显眼（与水面，窗帘的颜色不同）的标志物（如圆形，方形，五角星，三角形等）可以贴在桶臂上，也可以贴在帘子上（需避免帘子在实验过程中晃动），或者房间墙壁上（此时需要没有帘子）

• 将水面按照标记物的位置分为4个象限，并将平台放置于一个象限的ZX

• 将平台置于水下1-2厘米深（加入染料后，根据动物游泳过程中水面波动后，水平台不会露出水面即可）。不宜太深，平台过深会导致动物到达平台后仍然继续游走

• 在平台上放置一个高于水面的标记物，使动物可以通过标记物确认平台位置

(2)时间

根据动物学习记忆水平，可设置0-6天的学习时间

(3)方法

将动物分别从不同象限放入水中，让动物自由活动寻找平台。

• 动物找到平台：记录时间，让动物在平台停留30s，观察周围环境

• 动物未找到平台：动物自由活动1-2min（实验中保持一致，推荐1min）后， 将动物引导至平台所在处，并停留30s，让动物观察周围环境

每只动物每天分别随机从4个象限各进行一次实验，两次实验需要间隔至少2-3min（推荐2min），让动物补充体力。（方法一：两只动物同时开展实验，交替进行学习，即动物A进行Trial1，接下来动物B进行Trial1，动物A进行Trial2依次进行实验。方法二：单只动物进行4个Trial实验后，再开展另外一只动物训练实验。）

(4)记录数据

第  一次到达平台的时间（潜伏期），总活动轨迹、距离。

• 总活动轨迹用于判断动物是否有不利于实验结果的行为习惯（如绕圈，跳跃等），必要时以此剔除动物

• 总活动距离仅做动物活跃程度参考，受潜伏期以及动物活跃程度影响

• 潜伏期越短说明动物已经学会找到平台这一行为，学习能力越强

02、平台学习

(1)实验设置：取下平台上高于水面的标记物，其余保持不变

(2)时间：根据动物学习记忆水平，可设置4-7天的学习时间

(3)方法：

将动物分别从不同象限放入水中，让动物自由活动寻找平台。

• 动物找到平台：记录时间，让动物在平台停留30s，观察周围环境

• 动物未找到平台：动物自由活动1-2min（实验中保持一致，推荐1min）后， 将动物引导至平台所在处，并停留30s，让动物观察周围环境

每只动物每天分别随机从4个象限各进行一次实验，两次实验需要间隔至少2-3min（推荐2min），让动物补充体力

(4)记录数据：第  一次到达平台的时间（潜伏期），总活动轨迹、距离

• 总活动轨迹用于判断动物是否有不良行为习惯（如绕圈，跳跃等），必要时以此剔除动物

• 总活动距离仅做动物活跃程度参考，受潜伏期以及动物活跃程度影响

• 潜伏期越短说明动物已经学会找到平台这一行为，学习能力越强

测试阶段

01、实验设置

去除水中的平台，其余保持不变

02、时间

平台学习结束后一天

03、方法

将动物在指定位置放入水迷宫中，让动物在水中自由活动1-2min（推荐1min，与学习阶段测试时间相同）

04、记录数据

主要包括：平台区域经过次数、平台区域停留时间、总活动轨迹与距离、不同象限活动时间、距离。

(1)经过平台区域次数为主要指标，经过次数越多，说明动物记忆越好

(2)平台区域停留时间作为经过平台次数的参考，部分动物可能会在平台区域停留，导致经过平台区域次数较少

(3)总活动轨迹可以作为实验结果进行展示

(4)当经过平台次数，停留时间无显著差异时，考虑分析平台所在象限的活动时间及距离是否有差异，部分动物可能对平台具体位置记忆不是特别清楚，但是会在平台附近区域反复移动

5.数据分析

1、不同时期分析的数据类型不同

2、采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法

3、P<0.05认为具有统计学显著性差异

6.注意事项

（1）实验时，建议将水温维持在21℃-23℃范围内。水温过低或过高均容易导致动物产生应激反应。

（2）实验时间周期设置应保证对照组对照组的动物学会的最短时间为标准，实验周期过长会让学会寻找平台的动物产生厌倦感，从而影响实验结果。

（3）每次实验结束后，需要将动物毛发擦干，避免动物受凉死亡。

（4）实验中需要在水中加入不易变质的染料，不仅可以增加水面与动物颜色的对比度，也可以防止动物透过透明的水看到平台。黑鼠棕鼠推荐使用钛白  粉做为染料（购买链接→）；白鼠推荐使用食用黑色素作为染料（购买链接→）。

另外还可选择使用透明浮珠，其有反射少、蒸发少等特点，但是阻力大，会导致小鼠游泳非常累，因此不推荐。

（5）实验进行过程中不要进行换水。虽然水池中会存在很多动物排泄物导致异味产生，但换水操作可能会导致动物认为进入了一个新的环境而影响实验结果。

（6）加入的染料易在水中沉降，每半天进行实验前应对水进行搅拌，使染料重新分布均匀。

（7）实验过程中每天都会有水的损耗，导致平台深度越来越浅。建议实验开始前确定一个标准水位，后续每天进行实验前，对迷宫进行补水。

（8）实验过程中应尽可能保持安静，避免声音影响动物对方向的判断。

（9）实验人员将鼠放入水迷宫后，应尽快离开动物视线区域以及视频记录区域，避免被动物当做标记物，或被视频记录识别为实验动物。

（10）固定时间点开展实验。由于动物节律问题，在一天不同的时间段进行实验会导致实验结果不同。建议实验过程中，不同实验组的动物逐只或逐2只进行实验，可以获得更为准确的实验结果。