AccuSizer FX Nano用于蛋白团聚检测

全文共 1851 字，阅读大约需要 6 分钟

1

基于蛋白质溶液疗法中的蛋白聚合可能会产生有害的免疫原性，较大粒径的聚合体可以测量，但0.15~2μm范围内的较小聚合体难以量化。动态光散射（DLS）技术虽然可以证明聚合体的存在，但不能提供聚合体绝对浓度的任何信息。单颗粒光学传感（SPOS）则可以测量聚合蛋白质的大小和浓度，为0.15~2μm范围内的较小聚合体的量化提供解决方案。

2

生物疗法容易诱导抗药物抗体（ADA）的产生。有研究表明，蛋白质聚合体和颗粒能够增强免疫原性，从而触发对蛋白质单体形式的免疫反应。

生物治疗蛋白的制造商通常通过一系列步骤制备注射用药物：

1. 蛋白质的合成和纯化

2. 运输过程中冻干以保持稳定

3. 在注射前重建

虽然冻干有利于稳定蛋白质运输，但冻干蛋白质在重组后是否会恢复到单体状态尚不清楚。如果该过程导致少量蛋白质聚合，那么在治疗过程中患者可能会产生免疫反应。

开发一种简单的方法来测量蛋白聚合程度，使其能够在重组后以大小与浓度的直方图显示数据，这种方法可以支持在制剂过程中筛选这些药物。该分析还可确保重组过程蛋白以单体形式释放，不会产生大量的聚合。

3

能够测量颗粒大小和浓度的大小范围来量化蛋白质聚合的技术较少。光阻法因被用于USP<788>注射剂中的颗粒物和USP<729>脂质乳剂的尾部大颗粒测量而熟知。传统的光阻传感器通常具有较低的粒径限制，接近1μm，且对于许多蛋白质聚合样品来说，其浓度限制太低。

图 1  PSS AccuSizer FX Nano

PSS AccuSizer FX Nano系统（如上图所示）可用于检测更小的粒径和更高的浓度。通过使用两个传感器来完成更小粒径和更高浓度的测量：FX Nano传感器测量0.15-0.6μm，LE400传感器测量0.5-40μm。FX Nano传感器使用聚焦光束来减少被检查的总体积，从而增加了传感器的浓度极限。该传感器与SIS进样器耦合，经过修改，允许采样量低至250μL。仪器配置满足USP<787>亚可见颗粒物质的要求。

聚合的蛋白质可以使用两个传感器进行大小的测量和计数，以覆盖0.15-40μm的动态范围。LE传感器单独使用时可以从0.5-400μm范围内开始工作，可以切换以满足不同的应用需求。

4

免疫球蛋白G(IgG)，~150kDa，PBS中浓度为1%。使用AccuSizer FX Nano、FX和LE传感器和SIS测样器测量未稀释的样品。结果如图2所示。总#粒子计数=109,343，浓度=9.7×10⁸粒子/mL。

图2：未过滤的IgG

样品还在Nicomp 3000动态光散射(DLS)系统上进行了分析（见图3），以评估单体的大小，并对聚合蛋白的粒径有一个粗略测量。峰#1（天然蛋白）：14.6nm，光强52%（总质量99.6%）。峰值#2（聚合尾）：395nm，光强48%（总质量0.4%）。利用200-500nm及更大的纳米尾部进行详细研究。

图3：未经过滤的IgG的DLSNicomp380数据

然后将蛋白质样品通过 0.2 μm 过滤器并在AccuSizer FX Nano 系统上再次分析，过滤前后的结果比较如图 4 所示，PBS的结果以黑色显示。过滤步骤后，浓度从9.7×10⁸降低到3.1×10⁸个颗粒/mL。AccuSizer FX Nano 系统清晰可见并轻松识别聚集颗粒尾部的减少。

图4：过滤前（蓝色）和过滤后（红色）

5

样品制备用于研究孵育对IgG蛋白样品的影响。图5显示了在37℃下孵育1小时和6小时后，孵育前IgG样品的粒径分布。此次仅使用AccuSizer FX系统测量样品。将粒径>0.7μm的样品定义为聚合蛋白，浓度降低如下：9.77×10⁵,7.75×10⁵，至5.08×10⁵颗粒/mL。随着热培养时间的增加，聚合程度降低，表明溶解得到改善。图6扩展了聚合体的尾部，以了解更多细节。

图5 时间0（蓝色）、1小时（红色）和6小时（黑色）

图 6 聚合蛋白尾部的扩展视图

6

客户提供了一种未知蛋白质，在AccuSizer FX Nano上分析了缓冲液和三种不同的制备/储存条件，以确定聚合蛋白质的粒径和浓度。缓冲液和蛋白质样品中大于0.19μm的颗粒浓度如表1所示。图形结果如图7和图8所示。

表1：缓冲液和三个蛋白质样品的颗粒浓度

图7：差异分析

图8：累计分布情况

图9和图10显示了相同的聚合蛋白质数据，是浓度在对数尺度上绘制的，以便更好地显示结果的大浓度范围。

图 9 差异分布、对数尺度

图10：累积分布、对数尺度

7

AccuSizer FX Nano技术提供了一种分析工具，能够轻松地定量蛋白质聚合物的粒径和浓度。两种独特的传感器方法动态范围广泛，并且可以提供一个详细的、高分辨率的聚合蛋白质的尾部粒子的结果。准确的计数/mL数据可以比较不同浓度样品的结果。SIS进样器可以使用此应用程序所需的小样本量。此外，通过去除FX Nano传感器，该系统满足标准USP<787>和<788>颗粒物的测验。