ibidi实验视频系列之简便免疫荧光实验

细胞的免疫荧光实验是一个基础的细胞实验，传统的方法是在培养板中放入预先处理好的盖玻片，待细胞贴壁后，使用镊子将盖玻片拿出再开始进行固定，染色等系列工作。

现在分享一种简便的免疫荧光方法，无需爬片，培养，固定，染色，成像，都在一个培养皿/载玻片上完成。

本文章介绍新方法，我们将描述在通道载玻片内培养大鼠成纤维细胞（Rat1）的单个实验案例。然后，我们用AlexaFluor®488鬼笔环肽染色F-肌动蛋白细胞骨架，并用DAPI对细胞核进行复染。

该实验包括四个主要步骤：培养，固定，染色，成像

一：培养
*在无菌条件下打开μ-Slide I ibiTreat（80106）并将其放在μ-Slide架（80003）上。将100μl 3×105细胞/ml Rat1细胞悬浮液加入通道中。如下图所示直接加入通道；
*用提供的盖子轻轻地盖住储液器。不要完全关闭它们；
*将架子放入培养箱（37°C;5％CO2）中，让细胞附着（60分钟）。然后用0.5ml无细胞培养基填充两个储库；
*培养过夜。

二：固定细胞
通过使用细胞培养抽吸装置或移液管从储库中吸出整个培养基。用Dulbecco's PBS洗涤细胞，缓慢地将1ml液体施加到一个空的储液器中，并从对面的储液器中吸出。

通过在PBS中使用200μl的3.7％多聚甲醛以相同的方法固定细胞。从通道的另一侧移除储液器的液体并等待10分钟。

清洗：
如步骤5中所述，用1ml PBS再次洗涤细胞。
在PBS中使用200μl0.1％Triton®X-100溶液通透3-5分钟。
在PBS溶液中施加200μl的1％BSA溶液封闭20分钟。
用PBS洗涤细胞。

三：染色镜检
*从通道中清除所有液体。从通道中吸出液体后，不要让通道干燥。
*用100μlAlexaFluor®488鬼笔环肽（1Unit+500μl PBS+1％BSA，InvitrogenCorp.）在室温下培养20分钟。
*用PBS洗涤细胞并清空通道。
*施用100μlDAPI（0.1μg/ml，Sigma-Aldrich）3-5分钟。
*用PBS洗涤细胞并除去所有液体。用滴管瓶注入100μl Ibidi安装介质。用提供的盖子盖住储液器。μ-Slide可以存储大约4周。
*在荧光显微镜下选择适当的滤镜，也可以使用浸油观察细胞。

四：成像
之所能如此简便完成免疫荧光实验，是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质，绝大多数细胞可以直接贴壁生长，而不需要另外包被。

同时，这些耗材的底部薄如盖玻片，可以直接使用倒置显微镜进行观察，得到高质量的成像，适用于显微镜比如共聚焦显微镜。

用通道载玻片免疫荧光方法，不仅更加简化实验步骤，而且可以节约试剂和细胞，同时还能得到更理想的成像效果。