常用蛋白质浓度测定方法汇总

       蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础。目前常用的蛋白测量的方法主要有BCA法、考马斯亮蓝法(Bradford)和Lowry法等。

      BCA法      

原理

       在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

实验步骤

1. 1.按试剂盒说明书配置BCA工作液；
   2.完全溶解蛋白质标准品，加到96孔板的蛋白标准品孔中，按照说明书要求对标品进行梯度稀释，加入BCA工作液，用酶标仪测定其吸光度；
   3.以样品浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线；
   4.待测样品中加入BCA工作液，测定吸光度，带入标准曲线中，计算样品浓度。
   与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

   
   

      考马斯亮蓝法(Bradford)法

原理

       考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，Zui大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有Zui大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

 实验步骤

1. 1.按试剂盒说明书配置Bradford染液；
   2.完全溶解蛋白质标准品，加到96孔板的蛋白标准品孔中，按照说明书要求对标品进行梯度稀释，加入染液和染料结合液后，用酶标仪测定其吸光度；
   3.以标品浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线；
   4.各孔中加入染液和染料结合液，测定样品吸光度，带入标准曲线中，计算样品浓度。
   Bradford法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质。

      斐林—酚试剂(Lowry)法

原理

       斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：Di一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关，在650nm波长下有Zui大光吸收。

实验步骤

       与上述两种方法大致相同

       LORRY法灵敏度高,重复性好，适于5～l00μg蛋白质的定量，耗时长，操作要严格计时，在实验中要特别注意排除还原物质、柠檬酸等的干扰作用才能得到最准确的实验结果。

       这几种方法共同点在于，都需要绘制标准曲线，而标准曲线及待测样品往往数量较多，为了缩短实验耗时，保证测量准确性，可使用酶标仪对吸光度进行测定。

AMR-100酶标仪

       AMR-100酶标仪是一款基于滤光片的高品质光吸收酶标仪，波长范围340nm~750nm，适合科研和临床的应用。适用96孔板，可满足不同通量的要求。7英寸触屏液晶显示，易于使用，不需操作键盘，数据和程序可保存在仪器内，或者通过U盘导出。读板速度快，能实现快速测量，提供准确性高，重现性好的测量结果。是实验室酶标仪的理想选择。

性能指标