超级干货~FFPE试剂国内外横评

FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）样本，即福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本，被视为病理科的“瑰宝”，因为它们保存了大量疾病相关信息，为医学研究提供了宝贵的数据来源，是目前长期保存病理样本的主要方法，过去的几十年中，按照该方法，全世界已经存档了大量生物样品。

然而，由于技术的限制，FFPE样本在过去的几十年中并未得到充分的利用。随着科技的进步和研究的发展，现在对FFPE样本的应用已经越来越广泛。从最初的免疫组化用于疾病诊断和病理分型，到现在已经应用到各种组学研究中，FFPE样本的价值得到了更全面的发掘。

每一个FFPE样本都是珍贵且独一无二的。在样本量有限的情况下，我们应当在尽可能减少损耗的同时释放其所蕴含的生物信息。现阶段在FFPE样本中提取核酸仍存在一定的挑战性。如石蜡样本在制作过程中导致的核酸降解，难以兼容下游qPCR、测序等应用，以及提取操作过程繁琐用时较长，试剂中二甲苯会危害实验员健康，其次二甲苯会影响组织切片质量，若使用不当，容易使组织产生收缩、硬化变脆等变化。

因此我们需要在有限的样本中尽可能提取出高质量的核酸，同时实现提取操作自动化，在这里我们展示的是奥盛试剂盒从大鼠石蜡包埋组织样本和人体组织样本中提取基因组DNA的方法，与市面上同类型试剂盒提取效果进行对比，结果显示，DNA提取浓度、完整性等方面与国内外同类型产品表现一致。

配制三个不同批次的试剂，根据FFPE切片/卷片组织面积的大小，刮取5-10张表面积为25-30mm2的卷片，分别进行手工法提取，等体积（50 μL）洗脱所有样本提取流程如图1所示，将所得纯化的DNA通过Fluo-200荧光计dsDNA高灵敏定量分析试剂盒精准定量提取浓度（dsDNA），并通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA完整性，使用GAPDH基因（扩增片段长度分别为322bp和99bp）对DNA产物进行qPCR分析，所有样本的起始体积/量一致。

奥盛试剂盒和其他国内外三种对标试剂盒分别提取不同人组织FFPE样本，等体积（50 μL）洗脱所有样本，将所得纯化的DNA通过Fluo-200荧光计和dsDNA高灵敏定量分析试剂盒精准定量提取浓度（dsDNA），琼脂糖凝胶电泳验证DNA完整性，以及通过Allsheng? NGS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒进行不同品牌提取产物的建库产量及峰型图分析对比。与同类产品提取人体石蜡包埋组织样本比较。

为确定全自动和手动抽提方法是否可以获得相同的核酸产量和质量，我们使用奥盛试剂盒进行手动抽提以及在Leap-Pure S24上全自动提取连续的FFPE样本。每个样本上样量一致，洗脱体积均为50μL，进行对比测试。

对三批提取产物浓度测定分析发现，AllSheng?与A品牌试剂盒对不同FFPE组织样本的提取效率接近或超出对标试剂（图2-1），片段分布和片段完整性（用不同大小引物对产物进行扩增后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，均显示出完整的4条片段）与对标产品一致（图2-2、图2-3），对DNA产物进行GAPDH基因（扩增片段长度分别为322bp和99bp）qPCR分析，发现不同长度扩增片段浓度均无明显差异（图2-4）。

通过对不同人组织FFPE样本提取发现，四种试剂盒对不同样本的提取情况一致，奥盛试剂盒和其他国内外三种对标试剂盒对不同的样本提取效率有差异。在C样本提取中，奥盛试剂盒提取效率显著高于三种对标试剂盒(图3-1），三个样本的片段分布和片段完整性与对标产品一致（图3-2），将四种试剂盒提取产物投入相同量进行建库，奥盛试剂盒建库后的文库产量与另外三种试剂盒的文库产量无明显差异。