“CAR-T之父”Carl June合作团队开发新型癌症免疫疗法：“headless” CAR-T

嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞 (CAR-T) 免疫疗法已被证明在临床上可引起血液系统恶性肿瘤的持久缓解 ，然而， CAR-T疗法在实体瘤早期临床试验并未观察到类似在血液瘤上的疗 效。CAR-T疗法在治 疗实体肿瘤面临的主要挑战是疗 效差、T 细胞耗竭、脱靶毒性、细胞因子释放综合征 (CRS) 以及肿瘤中存在的免疫抑 制微环境持续抑 制CAR-T的功能。Thakur 博士与宾夕法尼亚大学的 Carl June 博士合作克服了这一障碍。他们使用安捷伦细胞分析仪器 (xCELLigence RTCA 、 Novocyte 流式细胞仪和Agilent Seahorse XFe 分析仪) 开发了配备双特异性抗体(BiAbs)的“headless”CAR-T (hCAR-T) 细胞。

Thakur 博士说：“治 疗产品的毒副作用以及疗 效是患者护理中Z值得关注的问题。我们预期配备有双特异性抗体的 hCAR-T 细胞可以有效地靶向肿瘤而不会产生严重的副作用。”这些经过修饰的细胞成功地在所有肿瘤类型中安全有效地杀死癌细胞，而没有传统 CAR-T 细胞疗法的风险。

顾名思义，“headless”CAR-T (hCAR-T) 与传统CAR-T的区别就在于没有CAR结构的胞外段ScFv，因此Thakur 博士团队设计了不同胞内共刺激域的hCAR-T（图1）。首先作者应用Novocyte流式细胞仪对长期扩增后的hCAR-T细胞的记忆，共刺激受体以及共抑 制受体进行表型分析（图2），结果表明CD8+ hCAR-T细胞表达更高的共刺激受体和较低的共抑 制受体。随后在Agilent xCELLigence RTCA上进行长时程杀伤实验的对比，结果表明在两种乳腺癌细胞系SK-BR-3和MBA-MD-231上结果均表明不同共刺激域的HER2 hCAR-T 的杀伤能力明显高于对照组（图3）。

图2.通过Novocyte流式细胞仪对hCAR-T细胞的记忆，共刺激受体以及共抑 制受体进行表型分析

图3.通过xCELLigence RTCA评估不同共刺激域的hCAR-T的杀伤能力

为了进一步验证hCAR-T的功能，研究者在RTCA上进行了长时程的连续性杀伤，如下图（图4）中，作者也详细描述了实验步骤和细节。其结果表明，HER2 hCAR-T41BBζ在每次杀伤中都展现更高的杀伤能力。

早有研究表明CAR-T41BBζ较CAR-TCD28ζ拥有更持久的效应功能，为了验证 hCAR-T41BBζ是否有类似功能，研究者利用Agilent Seahorse来实时监测细胞耗氧率（OCR），结果表明hCART41BBζ 较hCARTCD28ζ显示更高的备用呼吸能力（图5），这与在压力下的生存和持久性增强有关。因此hCART41BBζ在缺氧的肿瘤微环境中可能发挥更持久的效应功能。 

图4. Unarmed 或者BiAb Armed hCART, COATC 以及 ATC连续杀伤的比较

图5. 通过Seahorse 实验检测hCAR-T的代谢特征

总之，该临床前研究表明 hCART41BBζ杀伤作用明显，联合不同BATs在持续和连续性杀伤试验中杀死肿瘤靶点，分泌 Th1 细胞因子和趋化因子，并在体外缺氧条件下表现出特异性靶向杀伤。

其中安捷伦细胞分析仪器平台发挥重要作用：

• Seahorse XF 帮助研究人员实时检测细胞生物能量代谢不连续变化。

• xCELLigence RTCA 以高精度、高灵敏性和高稳定性来监测细胞的健康和功能。

• Novocyte 流式细胞仪以更高的灵敏度和分辨率检测细胞的理化特征。

参考文献：
Bispecific Antibody Armed Metabolically Enhanced Headless CAR T Cells. （2021）Front. Immunol. 12:690437.