基于UHPLC/MSD检测抗体制剂中游离脂肪酸的含量

研究背景

由于吐温（聚山梨酯，polysorbate）具有优良的稳定性、生物相容性和安全性，是抗体药物制剂处 方中常用的稳定剂。作为制剂的重要辅料，吐温既可以提高活性成分的溶解度，同时又可以抑 制蛋白药物的自动聚合。尽管吐温在多种生物制剂中被广泛应用，但由于不同供应商家产品中存在的副产物差异以及其对各种降解反应的敏感性，迫切需要合适的质控方法来监控吐温原料当中以及终端生物制品生命周期中的吐温质量。

在生物制剂配方的酸碱条件下或者具有脂肪酶/酯酶活性的残存的宿主细胞蛋白（HCP）的催化作用下，吐温可能发生水解，见图 1。吐温的降解不仅降低了表面活性剂的真实浓度，而且还与不溶性微粒的形成有关。中药注射液和化学药品注射液亦是常用吐温作为增溶剂、乳化剂或分散剂，制剂通常也会根据主药的化学性质进行 pH 值的调节，弱的酸碱条件下同样会导致吐温的水解。吐温原料本身的质量也有较大的差异，同时在长期的储存和流通中也会产生不同程度的水解。

图 1. 吐温 20 水解示意图

对吐温原料及其相关的不同类型制剂中的长期稳定性和安全性的关注促进了吐温表征和定量的分析方法的发展。安捷伦公司与科迈恩以及中国医学科学院/协和医学院药物研究所合作建立了吐温表征和检测的系列方案，如 UHPLC/QTOF 结合 Polymer Studio 软件用于吐温组成和降解产物精细表征，详细内容可参考往期微信推送。基于游离脂肪酸结构中无明显发色基团，并且抗体制剂中游离脂肪酸的含量较低，选择了灵敏度高、专属性强并且操作简单的单四极杆质谱法来检测游离脂肪酸。安捷伦实验室应用 ICH Q14 分析方法开发指导原则的 AQbD（analytical Quality by Design）理念开发了基于 UHPLC-MSD 单四极杆质谱的游离脂肪酸含量测定方法。

安捷伦多平台解决方案为吐温降解与抗体制剂中可见异物/不溶性微粒形成机制研究提供新思路

药 用辅料分析与质量控制 | LC-Q/TOF结合PolymerStudio 软件进行吐温成分精细表征和对比研究

药 用辅料分析与质量控制 ——UHPLC/Q-TOF结合PolymerStudio 软件进行吐温降解产物的研究

仪器和设备

采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统，配备如下：

二元泵（部件号 G7120A）

自动进样器（部件号 G7167B）

柱温箱（部件号 G7116B）

单四极杆质谱（部件号 G6125C）

色谱柱 Agilent Zorbax SB-C18 2.1 ×50 mm, 1.8 μm

方法开发与验证

样品前处理：操作简单，进行简单的蛋白沉淀，离心取上清液过滤后直接进样分析。

色谱质谱条件摸索：基于 ICH Q14 分析方法开发指导原则，进行色谱和质谱条件的摸索，如下表所示

3 种游离脂肪酸典型分离色谱图

方法学验证结果

分析方法色谱条件确定后，并按照 ICH Q2 的要求进行了方法学验证。

结 语

我们基于 ICH Q14 分析方法开发指导原则的 AQbD 理念，利用 UHPLC/MSD 单四极杆质谱和亚二微米 Zorbax SB-C18 色谱柱开发了抗体药物制剂中游离脂肪酸含量测定的方法，并按照药典要求进行了方法学验证。本方法样品基质和流动相无干扰，3 种游离脂肪酸线性相关性良好，相关系数 R2 均大于 0.999，平均回收率处于 86.85%-105.33% 的范围内，回收结果良好。

本方法能快速准确的检测抗体制剂中游离脂肪酸的含量，监控抗体制剂在运输、储存和流通过程中吐温由于酯酶或则 pH 作用导致的水解变化，为抗体制剂中吐温降解的研究提供灵敏的检测结果，同时也可以用于化学药物注射液、中药注射液以及吐温原料中吐温水解产生的游离脂肪酸的含量，用于评估制剂生命周期中的吐温的质量。

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