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解决方案
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引起抗体药物制剂中可见异物与不溶性微粒风险的宿主残留蛋白(HCP)定量分析与研究
发布:安捷伦科技(中国)有限公司浏览次数:347研究背景
宿主细胞蛋白(HCPs)是生物制品生产过程中产生的关键工艺相关杂质之一,除了我们熟知的可导致患者不良的免疫反应、超敏反应、引起蛋白降解等影响产品的安全性和有效性问题之外,近年来最 新的研究表明,HCPs 中的部分酯酶和脂肪酶参与了抗体药物制剂中吐温(聚山梨酯,polysorbate)的水解【1】。其中的一些脂肪酶和酯酶能够水解吐温结构中的酯键部位,生成游离脂肪酸和聚山梨醇,见下图 1。
图 1. 聚山梨酯 20(PS20)水解示意图
吐温是高度异质的混合物,容易通过多种途径发生降解,如化学水解、氧化水解和酶水解等。抗体制剂中吐温的降解不仅降低了表面活性剂的真实浓度,而且还与不溶性微粒的形成有关{2}。酶水解在目前被认为是在抗体药物中吐温降解的主要原因之一,如图 2。
图 2. 吐温水解通路示意图
由于酶催化吐温的水解反应在酶含量低至 ppm 水平时依然发生,因此建立 HCPs 酯酶/脂肪酶痕量水平的目标蛋白定量分析方法显得尤为重要。当前 HCPs 的分析方法当中,酶联免疫法(ELISA法)灵敏度高,能够检测到痕量 HCPs 残留,但是现有分析方法更加侧重 HCPs 总量的分析,缺乏针对导致吐温降解的 HCPs 酯酶/脂肪酶的目标蛋白分析方法,因此通用 HCP 试剂盒的 ELISA 方法检测到的 HCP 含量与吐温降解没有直接关联性。液相色谱高分辨质谱法(LC-HRMS)能够检测到不同种类的 HCPs,但是检测灵敏度不足,对于 ppm 水平含量的酯酶/脂肪酶无能为力。Agilent 创新应用中心使用 Agilent Infinity II 1290 接 6495C 三重四极杆质谱开发了 HCPs 定量方法。对于文献报道的导致吐温水解的5中酯酶/脂肪酶 {1}[3],检测定量限低至 0.5 ppm,方法灵敏度高,特征性好,是目前最 佳分析手段之一。所开发的方法可用于不同应用场景下的 HCPs 酯酶/脂肪酶检测,如细胞株筛选阶段、纯化工艺过程监控,或者放行检测等。
基于吐温降解以及可见异物/不溶性微粒形成对抗体制剂稳定性的重大影响,在 HCPs 定量方法之外,Agilent 也在跟行业用户的合作当中,对吐温降解导致不溶性微粒的研究提供全面的分析仪器技术支持,包括吐温定量、吐温精细表征、游离脂肪酸含量分析(见以下往期微信推送链接),助力抗体药物行业健康发展。
实验方案
仪器和设备
1290 infinity II Bio 生物大分子专用超高效液相色谱系统,配置如下
二元泵(G7132A)
自动进样器(部件号 G7137A),配多通道进样清洗系统
柱温箱(部件号 G7116B)
色谱柱
Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18,2.1 x100,1.8um
质谱系统
Agilent 6495C 三重四极杆质谱
方法开发与验证
样品处理 [4]
1、酶解,取 1mg mAb 药物,加入 10ul 1M 碳酸氢铵溶液,5uL 0.5mg/ml 的胰蛋白酶(Trypsin),用超纯水补足至 200uL,37℃ 孵育 4 小时;
2、蛋白沉淀:样品取出恢复到室温,加入 2uL 50 mg/ml DTT 溶液,90 ℃ 下加热 10min,取出后 13000 转离心 2min,取上清液上机。
方法验证
本实验对照品来自 5 种 HCPs 酶的 8 个合成特征肽段。进行了基于 NIST mAb 的基质添加回收率测试,定量限测试,线性测试实验。最 后使用开发的方法检测了实际样品——这些样品分别来自实际发现不溶性微粒的过期样品和工艺过程样品。
相关分析结果见后续谱图。
图 3. 特征肽段 LLOQ 水平(0.05ng/ml)基质添加色谱图
图 4. 特征肽段标准曲线
图 5. 特征肽段 NIST mAb 添加回收测试
结 语
抗体药物制剂中吐温会发生降解,进而产生不溶性微粒的风险,其中 HCP 酯酶水解是吐温的主要降解途径之一
吐温降解与可见异物/不溶性微粒形成机制研究过程中,需要全面使用 LC/ELSD 和 Bio LC SEC/VWD/MALs 分析技术平台,LC/MS&LC-MS/MS 分析技术平台,LC-QTOF 分析技术平台
Agilent 在跟行业用户的合作当中,对吐温降解导致不溶性微粒的研究提供全面的分析仪器技术支持,助力抗体药物行业健康发展。
参考文献:
[1]. NR. Larson, Yangjie Wei, et al. Comparison of Polysorbate 80 Hydrolysis and Oxidation on the Aggregation of a Monoclonal Antibody [J]. J Pharm Sci. 2020 Jan;109(1):633-639
[2]. 贾东晨,何伍。抗体药物制剂处 方中的可见异物/ 不溶性微粒,《中国新药杂志》2022 年第31 卷第10 期
[3]. X Gao, B Rawal, Y Wang, et al. Targeted Host Cell Protein Quantification by LC−MRM Enables Biologics Processing and Product Characterization[J]. Anal.Chem. 2020,92,1007−1015
[4]. L Huang, Ning Wang, CE Mitchell, et al. Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies [J]. Anal. Chem. 2017, 89, 10, 5436–5444
2023-10-31相关仪器 -
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